如何在体外培养类器官？创作培养皿中的3D微电影
2019年04月29日
来源：邦耀生物
作者：邦耀生物
责任编辑：admin
摘要：如果把培养皿比作是一个荧幕，那么2D细胞培养记录的是一帧一帧的画面，它生动地展示了细胞中的部分秘密，但却始终无法多层次地揭示来源组织的结构和功能。3D细胞培养则将器官特异性的细胞集聚一堂，以体内相似的方式分化来实现自我组建，以类器官为主角全新演绎出了更精确的人体组织微电影。本期，让我们一起窥探幕后花絮，看看如何在体外培养3D类器官？
前言
如果把培养皿比作是一个荧幕，那么2D细胞培养记录的是一帧一帧的画面，它生动地展示了细胞中的部分秘密，但却始终无法多层次地揭示来源组织的结构和功能。3D细胞培养则将器官特异性的细胞集聚一堂，以体内相似的方式分化来实现自我组建，以类器官为主角全新演绎出了更精确的人体组织微电影。本期，让我们一起窥探幕后花絮，看看如何在体外培养3D类器官？
类器官定义及特点
类器官（organoids）-- 通过在体外培养胚胎或成体干细胞，让其增殖分化形成具有一定形态结构及功能的类似于器官的3D细胞团结构。这些细胞结构虽然不是真正意义上的人类器官，但能在结构和功能上模拟真实器官，因此，其在科学研究中发挥着越来越重要的作用。与传统的2D细胞培养相比，3D类器官具有哪些优势呢？
表1. 2D细胞与3D类器官的比较
如下图，TOSHIRO SATO,等人在体外分离并培养鼠源的Lgr5-GFP阳性细胞，4-5天后单个细胞会逐渐增殖分裂形成一个类似于花环状的囊状细胞团，即为类器官[1]。这个囊状细胞团里不仅含有Lgr5类型的干细胞，而且还有Lysozyme阳性的潘氏细胞，Muc2阳性的杯状细胞，ChromograninA阳性的肠内分泌性细胞，及Villin阳性的肠上皮细胞。这暗示着肠干细胞不仅能够实现增值而且能分化形成各种细胞，并且类器官在体外能传代培养长达2年，同时保持其增殖和分化的特性。
图1. 单个的Lgr5-GFP会逐渐增殖分裂形成类器官的过程[1]
类器官的应用
3D类器官目前主要在个性化医疗、人类器官发育研究、疾病机制研究和药物筛选等方面均有重要作用。往期我们已经为大家详细介绍过，具体可见链接：精准医疗时代已经来临，这种名为"3D类器官" 的新工具你了解吗？
类器官培养
类器官培养从2009年发展至今，培养体系已经十分成熟，然而与传统的2D培养差距仍较大，如果没有专业的技术指导，初次尝试在体外构建类器官，还是有一定难度。现在我们就以小鼠的小肠类器官为例，详细地讲述构建类器官的过程！
基本过程：简单来说就是从组织分离出胚胎或多能干细胞，将它们培养在一个支持介质（如基质胶Matrigel）上，使其能够三维生长成包含多种已分化的细胞类型的类器官。
图2. 在体外构建小鼠小肠类器官的流程
一、实验前准备
解剖工具，灭菌PBS（预冷且加入双抗），基质胶matrigel（BD Biosciences，提前2-3h于冰上化冻），24孔板置于培养箱中预热。
二、完全培养基的配制（基础培养基添加生长因子）
基础培养基
B27 50x (Invitrogen)
N2 100x (Invitrogen)
N-Acetyl-L-cysteine1mM (Sigma-Aldrich)
Glutamax100x (Invitrogen)
HEPES 10mM (Invitrogen)
Primocin500x (Invitrogen)
AdvancedDMEM/F12, ADMEM (Invitrogen)
生长因子
Mouse-EGF（鼠源的表皮生长因子）50ng/ml (Invitrogen)，m-EGF和小肠的增殖相关；
HumanR-spondin1 500ng/ml （WNT信号的激动剂）(Peprotech)，诱导体内隐窝增生；
Mouse-noggin（BMP的抑制剂） 100ng/ml (Peprotech) 能诱导隐窝数目的扩增。
注：培养基配置时一次不要太多，建议一次配20ml，配制好后用0.22um的滤器过滤（过滤的目的是除菌），置于4℃可保存4周。
三、隐窝分离及接板
- 解剖6-8周的小鼠，取胃以下约10cm的小肠，镊子去肠系膜，剪刀沿肠道剪开，用预冷的PBS洗3-5次，用载玻片小心的将小肠表面的绒毛刮去（显微镜下镜检），将刮好的小肠放入50ml离心管中，置于冰上；
- 将小肠转移至生物安全柜中，用含双抗的PBS清洗3-5次，将小肠转移至25ml 2mM的EDTA（PH=8.0）的溶液中4℃冰箱中消化25min；
- 将消化好的小肠转移至50 ml离心管中用含双抗的PBS 清洗2次；
- 加入25ml PBS适当摇晃20-40下，取部分悬液镜检直至能看到大量的隐窝。悬浮液用70um的过滤筛过滤到新的50ml离心管中；
- 重复步骤4，两次收集的滤液800rpm 离心5min；
- 弃上清，用2ml的ADMEM重悬沉淀，取适量的悬液计数；隐窝的数量控制在10-15个/ul 最佳；
- 取适当体积的悬液加入到1.5ml的离心管中，室温下800rpm离心5min；
- 弃上清，用预冷的matrigel重悬（需充分混匀）；
- 接板，24孔板接50ul的重悬液（将matrigel种在孔中间避免贴壁）；
- 将接种好的板于培养箱中放置20-30min；
- 每孔加500ul完全培养基，然后每隔2-3天换一次培养基，5-7天传代一次。
注：所有的操作都要避免染菌，且组织需尽可能至于冰上。
四、Organoids传代
- 将传代的隐窝冰上放置5-10min；
- 小心吸出上清，并加入预冷的1ml 的ADMEM用大枪头将matrigel打碎，然后调制700ul量程，吹打30下左右，此过程避免产生气泡。可取适量的悬液观察，直至看不到大块的隐窝为止；
- 将悬液转移至1.5ml离心管中，室温800rpm离心 5min；
- 后续接板步骤与隐窝接板步骤第8-11步一样。
注：理论上传一次可以扩增3-5倍，但由于操作过程中的损失，因此一般只能扩增3倍。
五、Organoids 的冻存及复苏
冻存时，注意培养基不同，配方为10%的DMSO，20%FBS，ADMEM补足，将悬液转移至冻存管后，放入冻存盒中于-80℃冰箱中保存24h，如需长久保存，则24h后放入液氮罐中保存。复苏步骤与复苏一般细胞相同。
六、Organiods 评价
如下图所示，为成功培养的小肠3D类器官示意图：
图3. 构建成功的小肠类器官
备注：左：接板后第一天的小肠类器官，箭头所指为刚变圆隐窝，清楚可见paneth细胞；右：接板后第5天的小肠类器官，箭头所指为出芽的类器官
七、常见问题及解决方法
隐窝消化时间过长导致存活率过低？--减少消化时间及摇晃隐窝次数
类器官存活但不能出芽？--可能是生长因子失活或培养基放置过久，可更换生长因子或重新配置培养基
类器官的污染？--加双抗及注意无菌操作
传代时隐窝存活率低？--传代的前三天加Y276302,ROCK抑制剂可抑制细胞失巢凋亡
幕后揭秘到这里就结束了，很荣幸我们邦耀实验室也曾出品过两部关于类器官的3D微电影。2016-2017年，我们实验室先后利用了小鼠及人的肠道类器官构建了筛选P-glycoprotein (P-gp)抑制剂的模型，证实了肠道类器官作为筛药模型的可行性[2-3]。
P-gp主要是将内源性物质、外源性物质（如药物）以及毒素排出细胞外，是机体抵御不良环境的一道天然屏障，但同时也是限制口服药物吸收及抗药耐药长生的主要因素。P-gp在体内表达于小肠绒毛区域，而在类器官中表达于类绒毛区即花环状的内圈部分。我们分别利用P-gp 的一代，二代及三代抑制剂分别进行试验，发现均能达到较好的抑制效果。
图4. P-gp在小鼠小肠及类器官中的表达[2]
上面就是本期为大家奉上的精彩内容了，大家如果对3D类器官培养感兴趣，欢迎参与下方群聊或者留言讨论！
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上海邦耀生物科技有限公司成立于2013年9月，是一家以基因编辑技术引领创新、探索和开发突破性的疗法、预防和治疗威胁生命的疾病、造福全人类为使命的高新技术企业，总部位于上海紫竹科学园区。邦耀生物依托在基因编辑、免疫学领域的强大技术实力和科研团队，致力于基因突变引起的遗传疾病的基因治疗、以及基因编辑与细胞治疗的研发与转化，现已成功构建通用型CAR-T的研发转化平台，并拥有两个1000平米独立的GMP中试基地，用于开展基因与细胞治疗的系列转化研究与生产；另外，邦耀下设两个独立团队，分别专注于免疫及肿瘤药物研发和CRO服务，在加速自身研发与转化的同时为客户提供优质的产品和技术服务。
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参考文献：
[1] Sato, T., et al. (2009). "Single Lgr5 stem cells buildcryptvillus structures in vitro without a mesenchymal niche." Nature459(7244): 262-265.
[2] Zhang Y, Zeng Z, Zhao J, et al. Measurement of Rhodamine123 in Three-Dimensional Organoids: A Novel Model for P-Glycoprotein InhibitorScreening[J]. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology,2016, 119(4):349-352.
[3] Zhao J, Zeng Z, Sun J, et al. A Novel Model ofP‐Glycoprotein Inhibitor Screening Using Human Small Intestinal Organoids[J].Basic Clin Pharmacol Toxicol, 2017, 120(3):250-255.
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