摘要：人角膜基质干细胞（CSSC）抑制小鼠伤口愈合模型中的角膜基质瘢痕形成，促进天然透明组织的再生。本研究探讨了压缩胶原蛋白凝胶（CGG）作为一种载体来提供CSSC角膜治疗的功效。从人类供体角膜缘基质分离的CSSC嵌入可溶的大鼠肌腱胶原中，在37°C下凝胶化，通过被动吸收部分脱水至100μm的厚度。CCG圆盘尺寸稳定，易于操作，可以用纤维蛋白粘合剂牢固地粘附在去上皮化的小鼠角膜上。CCSG在培养基中的存活率＞80%，在培养基中维持在1周以上，在20%的胎牛血清中，10%的DMSO在液氮中冷冻保存。含有500个CSSC的CCG能有效阻止可见瘢痕形成，抑制纤维化col3a1 mRNA的表达。CSC在CSG中更有效地阻止瘢痕形成。胶原嵌入细胞在常规冷冻保存后仍能抑制角膜瘢痕形成。本研究展示了一种常见的生物材料的使用，这种材料可以促进干细胞的储存和处理，这种方法可以提供干细胞的现成输送，作为角膜瘢痕的治疗方法。

 

简介：角膜失明、白内障、青光眼和年龄相关性黄斑变性是世界性失明的主要原因之一。这在发展中国家尤其如此，据估计35%-50%的失明是由角膜瘢痕造成的。角膜瘢痕的标准治疗方法是角膜移植，用同种异体供体组织替代瘢痕角膜组织。角膜的免疫特权地位使得移植取得了显著的成功，使角膜成为所有器官中移植最频繁的一个。然而，这种治疗依赖于捐赠角膜组织的可用性，这在全球许多地区都受到严重限制。估计70例角膜瘢痕患者中只有一例能接触到供体组织。因此，在世界上许多地区，供体组织不可用，角膜失明得不到治疗。已经提出了一些克服供体短缺的策略，包括人工角膜和各种生物材料来替换疤痕组织，但迄今为止还没有长期有效的解决方案。解决这个问题的另一种方法是使用干细胞疗法来预防或修复角膜瘢痕组织的沉积。我们的研究小组最近证实，应用人类角膜基质干细胞（CSSC）可阻止小鼠基质伤口愈合过程中瘢痕组织的沉积，促进透明基质组织的再生。CSSC是从角膜基质分离出来的间质干细胞，与维持角膜上皮稳态的角膜缘上皮细胞不同。在损伤后立即在纤维蛋白凝胶中加入CSSC，导致透明性增加，纤维化基质成分减少，基质层组织重建。随后的研究揭示了CSSC分泌的肿瘤坏死因子α刺激基因6蛋白（TSG-6）在防止中性粒细胞浸润受损角膜中的重要作用。CSSC可以从已经在临床上进行的微创活检中获得，这表明它们可能为角膜瘢痕提供有效的自体治疗。同时，使用CSSC治疗已有角膜瘢痕的临床试验正在进行中。胶原凝胶支架由于其生物相容性、抗原性低、生物降解性高等优点，在组织工程中得到了成功的应用，但在组织工程中使用胶原凝胶的一个潜在缺陷是其机械强度和变形性。人们对提高胶原凝胶机械稳定性的各种方法进行了测试。胶原的化学交联可以增强材料的强度，交联胶原已被用于植入物替代角膜组织。然而，交联剂，例如戊二醛，对嵌入的细胞具有细胞毒性。为了增加胶原蛋白凝胶硬度，而不影响其生物相容性，布朗等人。另外一些人开发了一种技术，通过压缩和被动吸收使凝胶脱水来生产塑料压缩胶原凝胶（CCG）。这些塑料CCG大大提高了强度和硬度，并且可在不致细胞毒性的情况下产生嵌入细胞。包括CSSC在内的角膜基质细胞已成功地嵌入CCG中，并作为角膜上皮细胞的饲养层。因此，该技术与CSSC的生存能力兼容明显。在这项研究中，我们检查了CCG作为一种运输CSSC到受伤角膜的载体。CCG改善了CSSC的处理，提高了治疗的效力，并允许CSSC在治疗就绪状态下储存。

 

制备CCG：压缩胶原水凝胶是使用RAFT试剂根据制造商的协议。简单地说，酸溶性大鼠尾胶原在含有1×基础培养基和CSSC细胞的溶液中中和并稀释至1.6 mg/ml的浓度。将胶原蛋白溶液（通常为1毫升）转移到含有12毫米圆形玻璃盖片的24孔培养皿的培养孔中。胶原在37°C二氧化碳培养箱中凝胶1小时，然后在室温下用纤维吸收剂在层流罩中脱水15分钟。将胶原凝胶转移到含无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的60 mm培养皿中。制备2mm的院校凝胶，无细胞的CCG凝胶储存在无菌PBS中。含细胞的CCG在37°C的二氧化碳培养箱中培养2周。.切片前用Dylight 633对部分无细胞的CCG凝胶进行染色。用0.1 M NaHCO3冲洗凝胶，并在0.1 M NaHCO3（pH8.5）中用0.25 mg/ml的Dylight 633 NHS酯活性染料室温下染色2小时。在无菌PBS中清洗CCG，并在4°C下储存直至使用。

 

CSSC分离：从宾夕法尼亚州匹兹堡的器官恢复和教育中心获得了经鉴定的60岁以下捐助者批准用于研究目的的人角膜巩膜缘。摘取后5天内使用组织。用胶原酶消化法从分离的边缘组织中获得CSSC。将CSSC接种到2%（VOL/VOL）混合型人血清干细胞生长培养基中。培养基每隔3天更换一次，当80%的细胞融合到培养瓶中，用胰蛋白酶快速快速消化传代细胞，并在传代时冷冻保存。为了冻存凝胶，用CSSC（每2毫米凝胶含2000个细胞）填充的CGG转移到含有20%胎牛血清和10% DMSO的DMEM培养基中。溶液在核磁共振仪中缓慢冷却。将冻融凝胶置于80°C冷冻室中过夜，并转移至液氮中，以便长期保存。为了重复使用，冻融凝胶在37°C水浴中迅速解冻，在使用前4～16小时，37℃时凝胶在血清游离干细胞生长培养基中平衡。

 

细胞染色：用胰蛋白酶消化离心后收集CSSC细胞，悬浮于无血清的DMEM/F12中，每毫升106细胞，37℃时，用Vybrant DiO在50ug/ml下进行染色。孵育20分钟后，离心细胞，除去上清液，加入新鲜培养基。活的和死的CSSC在37°C含50μg/ml钙蛋白AM培养基中孵育20分钟，然后在5μg/ml碘化物中孵育5分钟。

 

小鼠角膜损伤模型：雌性C57/BL6小鼠，7-8周龄，饲养在AALAC批准的ABSL2设施中，并提供无限制的标准饮食。6组小鼠腹腔注射氯胺酮（50 mg/kg）和甲苯嗪（5 mg/kg）进行麻醉。在可见疤痕分析中至少需要6只眼睛进行统计意义分析，并且2周为基因表达和纤维化分析提供了一个合适的时间点。在局部麻醉清创前，每只眼睛加一滴盐酸丙卡因（0.5%）。将AlgerbrushII穿过小鼠角膜中心2毫米处进行角膜上皮清创。移除上皮后，再次应用Algerbrush II，这一次施加更大的压力以去除基底膜和10-15μm的前基质组织。手术后立即给小鼠服用酮洛芬（3 mg/kg）进行镇痛。两只眼睛都受到同样的伤害和治疗。

 

纤维蛋白凝胶与CSSC的应用：在PBS中特定浓度的CSSC与人纤维蛋白原混合1:1，在PBS中为70 mg/ml，并保存在冰上。角膜受伤后，在伤口处加入0.5μl凝血酶（100 U/ml），随后立即加入1μl纤维蛋白原（有或无CSSC）。纤维蛋白胶凝1-2分钟，应用第二轮凝血酶和纤维蛋白原。用庆大霉素滴眼液（0.3%）治疗创面。角膜上皮在24-36小时内愈合。每天检查眼睛有无排斥和感染的迹象，持续1周，此后每周检查一次。

 

CCG在角膜上的放置：最初在离体切除的小鼠眼睛上，随后在活体角膜损伤后眼睛上，用PBS冲洗眼睛，并在伤口处添加1微升凝血酶。如上文所述，将2 mm CCG圆盘轻轻地放在角膜上，然后再放1μl纤维蛋白原。这个过程导致压缩的胶原蛋白牢固地粘附在眼睛表面。

 

CCG角膜单侧成像：用Olympus FV1000共聚焦显微镜对CCG中的标记细胞进行成像，用Olympus SZX解剖显微镜和表观荧光光学对小鼠眼的凝胶进行成像。切除的小鼠眼睛在4°C的3.2%多聚甲醛PBS中固定过夜，并进行冷冻切片或石蜡组织学检查。

 

疤痕评估：角膜清创两周后，收集所有的眼睛，用间接照明解剖显微镜对整个球体进行成像。根据这些图像确定疤痕区域。角膜染色：将上述损伤2周的角膜石蜡切片（8μm）脱蜡并用H&E染色，以观察组织形态。为了证明III型胶原，在10 mM柠檬酸钠（pH6）中通过微波处理去除了部分的芳基化，其中含有0.5%wt/vol的吐温20。

 

结果：在压缩胶原中嵌入CSSC：评估CCG作为CSSC运载工具的潜在用途，我们首先检测了产生含有活细胞的凝胶的能力，这种凝胶的厚度薄到可以在小鼠角膜上产生一条光路。。小鼠中央角膜厚度仅为120微米。因此，我们努力生产一种厚度最小的凝胶，以限制眨眼反射时眼睛的刺激和眼睑凝胶的去除。结果CCG的厚度随加入的胶原量而变化，但至少达到约100μm，每孔约3 mg胶原。降低胶原含量低于3 mg可降低压缩凝胶中胶原的浓度，但不是厚度。在凝胶化过程中向胶原溶液中添加CSSC表明，脱水后细胞的存活率保持在90%以上，与加入凝胶的细胞相似。CSSC在CCG中以20-50μm的聚集体形式分布。

 

CCG对小鼠角膜的粘附作用：为了测试CGG与角膜的粘附，用70% EtOH将角膜上皮离体10秒钟，然后用泡沫尖端涂抹器刮除角膜上皮。用染料633标记的凝胶可以用纤维蛋白原和凝血酶牢固地附着在暴露的角膜基质上。用Algerbrush清创术发现CCG能很好地粘附角膜。标记的CSSC嵌入CCG中，在CCG粘附后可在眼睛上看到。有趣的是，CCG在体内粘附2天后，CCG不再出现在眼表面，也没有标记细胞可见。

 

CSSC植入预防角膜瘢痕形成：在上皮细胞和角膜基底膜清创后，用纤维蛋白凝胶将CSSC移植到基质中，从而防止小鼠角膜纤维化。为了观察CSSC在植入CCG时是否保持抑制瘢痕形成的能力，在基质损伤后立即将植入或不植入CSSC的CCG粘附在小鼠角膜表面。大多数用无细胞CCG治疗的眼睛（仅CCG）在受伤后14天出现可见的基质疤痕。当CCGS含有CSSC时，很少出现瘢痕。尽管实验之间的比率有所不同，但从统计学上看，CCG中CSSC的存在始终能显著抑制角膜瘢痕形成。角膜瘢痕含有细胞外基质和不寻常的结缔组织成分。这种纤维化基质被认为是光散射的来源，有助于角膜瘢痕引起的视力中断。. 角膜瘢痕的两个分子标记物是胶原III型和平滑肌肌动蛋白，是小鼠col3a1和acta2基因的产物。正如我们之前所证明的，这两个基因在受伤14天后在角膜中都表现出明显的上调。当CSSC出现在覆盖受伤眼睛的CCG中时，激活明显减弱。

 

CCG中的CSSC诱导基质形态学修复：为评价经或不经CSSC CCG治疗的角膜基质再生情况，伤后14天用H&E染色分析组织切片。结果表明，CCG治疗只导致组织水肿、细胞增生和伤口愈合区上皮覆盖不均。暴露于负载CSSC的CCG的角膜显示出与正常角膜不可区分的组织学，显示了通过Algerbrush清创术移除区域的原生角膜组织再生。角膜水肿区愈合无CSSC细胞，含胶原III，这是角膜瘢痕形成的一个众所周知的标志，而用含有干细胞的CCG处理的组织没有染色胶原蛋白III。

 

CSSC在CCG中的剂量反应：在以往的研究中，50000个CSC细胞在纤维蛋白凝胶中用于抑制角膜伤口瘢痕形成。此浓度表示在愈合过程中纤维蛋白凝胶中保留在小鼠角膜表面上的最大细胞数。为了评估CSSC抑制角膜瘢痕所需的有效剂量，将CSSC细胞以不同浓度（50-2500个细胞）嵌入CCG中。角膜瘢痕分析显示，50个细胞对瘢痕无抑制作用，125，500和2500个细胞对瘢痕有显著抑制作用。将CCG中的500个CSSC与相同数量的纤维蛋白原细胞进行比较，观察到嵌入CCG中的每个CSSC细胞的有效性显著增加。

 

CSSC在CCG中的冷冻保存：为了评估CSSC冷冻保存后的效果，我们使用一种通常用于培养细胞的方法，将含有细胞的CCG冷冻在液氮中。贮存2周后，凝胶冻融，在无血清培养基中培养过夜，用钙黄绿素AM活力染料标记。显微镜下这些细胞是活的，并且已经凝聚成50-100μm的聚集物。在小鼠伤口愈合模型中使用冷冻/解冻的CCG显示保存的细胞对角膜瘢痕的高度有效抑制。

 

结论：将CSSC植入CCG中是一种快速、简便的方法，可以防止透明角膜组织瘢痕形成和诱导其再生。这种新的方法可能会给大量患有角膜瘢痕的患者带来治疗的潜力。