摘要：随着年龄的增长，周围神经的再生能力下降，有助于神经病变的发展，限制了机体的功能。 Schwann细胞的变化导致老化神经的维持和再生失败，其分子机制尚未被阐明。我们发现了一种炎症环境的改变导致了有缺陷的Schwann细胞反应，这是衰老过程中神经再生受损的一种潜在机制。在完整的未受伤的旧神经中检测到慢性炎症，其特征是巨噬细胞浸润增加，单核细胞趋化蛋白1（MCP1）和CC趋化因子配体11（CCL11）水平升高。.旧神经中的Schwann细胞出现部分去分化，伴随着一个独立于损伤的激活修复程序。坐骨神经损伤后，最初的免疫反应延迟，接着是持续的高炎症状态，伴随着修复过程的减少。结果表明，CCL11对体外和体内Schwann细胞的分化有一定的干扰作用。研究结果表明，巨噬细胞浸润和炎症信号的增加通过改变Schwann细胞的行为降低了老化神经的再生能力。这项研究确定CCL11是一个有希望的目标，抗炎疗法旨在改善老年神经再生。

 

简介：哺乳动物的外周神经系统（PNS）保持着高再生能力，即使在成人中也能实现轴突的长距离再生和功能恢复。这种再生潜能在成年哺乳动物中降低；周围神经修复变得缓慢、不完全和/或不起作用。但在理解PNS老化的分子和细胞机制方面的进展有限，阻碍了老年患者合理的康复疗法的发展。因此，我们的目的是发现衰老如何损害周围神经的维持和再生过程。创伤性损伤后，周围神经进行多步骤修复，包括华勒变性、轴突再生和靶向再神经化。华勒氏变性的特征如下：（a）从相关轴突中分离出Schwann细胞，（b）将这些Schwann细胞转变为“修复Schwann细胞”表型，（c）血液-神经屏障的破坏，和（D）巨噬细胞流入组织，（E）与“修复Schwann细胞”协同，吞噬轴突和髓鞘衍生的碎片。在再生阶段，巨噬细胞支持“修复Schwann细胞”，以介导轴突再生，重新调节靶组织。当炎性过程消失并“修复Schwann细胞”再分化时，再生完成。需要几种不同类型的神经元、Schwann细胞和免疫细胞的作用，以确保周围神经修复成功。神经元的内在生长能力似乎不受老化的影响，这表明老年动物的缺陷是由于环境受损造成的，老化的Schwann细胞和巨噬细胞在清除碎片方面效率较低。两项关键性研究证实，老年动物再生轴突环境存在缺陷。前者观察到Schwann细胞行为和延迟修复程序激活的年龄依赖性差异。体外Schwann细胞和巨噬细胞的吞噬活性减弱，提示老年啮齿动物神经再生缓慢是Schwann细胞和巨噬细胞功能修复失败的原因。本研究旨在探讨完整及再生旧神经之炎性神经环境。我们通过影响Schwann细胞修复过程，证明炎症性神经微环境的改变是影响老年周围神经维持和再生的一个因素。

 

与年龄相关损伤的周围神经再生：越来越多的研究表明周围神经再生能力随年龄而下降，但对潜在机制的了解仍然有限。为了更好地了解年龄依赖性因素对周围神经再生的影响，我们对两个不同年龄的C57BL/6J小鼠进行了坐骨神经挤压损伤，该鼠的平均预期寿命为24个月。限定20月龄的小鼠为“老”鼠，6月龄的小鼠为“成年”。老年小鼠表现为典型的老年特征，如驼背和毛皮。坐骨神经挤压损伤后，表现出感官功能恢复的显著延迟，由Semmes–Weinstein单丝试验表明。大部分感觉恢复可能是由于侧枝发芽引起的，因为大隐神经未受损伤，可能对爪区产生过度神经支配，导致观察到超敏反应。我们研究了在单帧运动分析（SFMA）中测量小鼠足底角的运动功能恢复，作为功能性肌肉再神经的一个高重复性标记。老年小鼠表现出明显的运动功能恢复延迟，也表现出脚趾伸展能力恢复延迟--周围神经损伤后运动再神经功能的一个替代指标。试验表明，周围神经挤压损伤后，老年小鼠功能恢复延迟，但几乎完全恢复。电生理特性进一步反映了功能性神经修复的差异。通过对挤压部位近端和远端坐骨神经的原位刺激，我们评估了两组完整和受损神经的复合神经动作电位（CNAP）和神经传导速度（NCV）。在挤压损伤4周后，我们发现老年小鼠的CNAP明显低于成年小鼠，这表明功能再生轴突数量较少。老年小鼠的受损神经表现出较慢的NCV，表明再髓鞘减少。为了在结构层面上评估神经再生，我们分析了挤压伤后4周完整的对照神经和坐骨神经的半薄横截面。成年小鼠的损伤神经表现为有髓鞘的小轴突，可能与再髓鞘轴突相似，几乎没有巨噬细胞。老年小鼠受损神经的轴突较少，直径较小，髓鞘较薄，巨噬细胞数量较多。与轴突直径相关的髓鞘厚度的量化显示两组再生神经之间的主要差异，特别是对于较大的轴突直径。对轴突密度、平均轴突直径和髓鞘厚度的研究显示，老年小鼠坐骨神经再生有缺陷，而g比值则没有随年龄而降低。损伤后不同时间点坐骨神经纵段免疫组化染色结果相似。老年小鼠神经损伤后3天出现迟发性华勒变性，随后出现迟发性和不完全性再髓鞘化。损伤后4周和8周，轴突再生对衰老的影响较小，这一点在损伤后4周和8周的再髓鞘边缘远端可见轴突再生，而在损伤后的老年小鼠坐骨神经中观察到的CNAP大幅下降。这可能是由于前文所述的再神经作用不足，并归因于可溶性靶源性神经营养因子与年龄相关的改变。我们的数据表明，神经损伤后4周，老年周围神经的形态再生不足。我们假设Schwann细胞的功能而不是轴突固有的特性会随着年龄的增长而下降，这是导致老年人周围神经修复能力下降的原因。

 

老年损伤反应和炎症微环境的改变：华勒变性是损伤神经有效再生的先决条件，涉及几种不同的细胞类型，包括巨噬细胞和其他免疫细胞。我们在挤压损伤前后的不同时间点进行了IBA-1免疫染色，以识别成年和老年坐骨神经中的巨噬细胞。老年小鼠坐骨神经中巨噬细胞数量似乎增加，与损伤无关，表明老年神经内存在慢性炎症微环境。与成年小鼠相比，老年小鼠神经损伤后（3天）巨噬细胞数量明显减少，但后期巨噬细胞浸润明显过度。这与半薄截面中显示的数据一致。坐骨神经溶解物上的IBA-1免疫印迹证实了这一发现，表明老年小鼠外周神经中慢性巨噬细胞的聚集较低，并且延迟，持续的损伤诱导炎症反应。我们分析了挤压损伤前后炎症微环境的年龄相关变化，筛选了成年和老年小鼠神经溶解液中的各种细胞因子、趋化因子和急性期蛋白。细胞因子表达水平的年龄依赖性变化在损伤和完整的神经中都可以检测到。成年小鼠在损伤后3天的表达显著升高，但在损伤后8周有效下调。老年小鼠损伤后3天细胞因子活性较低，8周后上调率较高；老年小鼠细胞因子表达延迟但延长，似乎与老年神经巨噬细胞浸润延迟但延长一致。在未损伤的神经中，细胞因子谱的比较确定了抗炎性细胞因子白细胞介素4（IL-4）、IL-13和IL-27的年龄依赖性下调，以及促炎性细胞因子单核细胞趋化蛋白1（MCP1）和CC趋化因子配体11（CCL11）的年龄依赖性上调。

 

抗炎治疗策略：乙酰水杨酸（ASA）抑制哺乳动物先天免疫反应，降低坐骨神经巨噬细胞浸润。为了测试ASA对老年小鼠损伤诱导的高炎性反应的抑制是否能改善周围神经再生，我们用两组老年小鼠建立了一个为期四周的治疗方案。“ASA”动物从受伤后第3天开始，每隔2天接受低剂量的ASA（PBS为10 mg/kg）。“赋形剂”对照动物只接受等量的PBS。通过使用SFMA和脚趾扩散分析监测运动功能恢复，以及使用Semmes–Weinstein单丝试验监测感觉功能，测试治疗效果。ASA治疗对所有试验参数都有显著的益处。细胞因子分析证实了ASA治疗对老年小鼠损伤后四周持续炎症反应的抑制作用。细胞因子下调到未受损伤的控制水平或更低，包括MCP1和CCL11。通过纵向切片观察ASA对挤压损伤后4周巨噬细胞浸润的影响。巨噬细胞一般用IBA-1染色，促炎性M1和促再生性M2巨噬细胞用iNOS和精氨酸酶1鉴别。染色的量化显示：（a）总细胞密度（用dapi染色）、（b）巨噬细胞总数（iba-1）、（c）促炎性M1巨噬细胞（iOS）和（d）促再生M2巨噬细胞显著降低。炎症反应降低伴随着再髓鞘的改善，表现为组织切片中髓鞘蛋白0（MPZ）信号增加和整个神经溶解液中髓鞘碱性蛋白（MBP）的21.5-kDa亚型的再髓鞘特异性上调。ASA处理后，phosho-erk1/2略有增加，再次表明再生能力有所改善。此外，电生理测量显示ASA处理的老年小鼠在挤压4周后CNAP和NCV增加，但这一趋势没有达到统计显著水平。我们的数据表明，低剂量ASA治疗后损伤诱导的炎症反应显著降低，并强调抗炎治疗对老年小鼠周围神经再生的有益作用。

 

CCL11在体外和体内抑制Schwann细胞髓鞘化：为了阐明老年周围神经发炎和再髓鞘减少之间的联系，我们继续关注CCL11和MCP1，在我们的细胞因子分析和RNA测序方法中，它们随着年龄的增长而上调。去神经Schwann细胞表达MCP1，一种有效的巨噬细胞吸引因子。CCL11也被称为嗜酸性粒细胞免疫细胞的趋化因子，并被M1和M2巨噬细胞分泌。两种细胞因子均在损伤后两天内在坐骨神经局部表达。我们证实了它们在外植体培养损伤后的局部上调，支持正常周围神经修复和炎症的关键作用。尽管高水平的MCP1可能是导致旧的完整坐骨神经巨噬细胞浸润增加的原因，但CCL11对老年周围神经的影响仍然不清楚。CCL11与CC趋化因子受体（CCR）2、3和5型结合。然而，在我们的转录组分析中几乎检测不到与嗜酸性粒细胞吸引有关的主要受体CCR3的表达，而CCR2和CCR5则有明显的表达。此外，与配体CCL11相似，CCR5在老年时上调。在外周神经损伤后，发现Schwann细胞和巨噬细胞都表达CCR5，并有明显的上调作用。我们假设CCL11可能直接参与了Schwann细胞行为的调节，并在与DRG神经元和Schwann细胞共培养系统中进行了测试。从小鼠胚胎中分离的DRG在培养基中培养6天，然后在含有CCL11或载体的髓鞘培养基中培养8天。用染色和qpcr评价髓鞘形成。在CCL11处理的样本中，MBP作为髓鞘标记物和神经丝重多肽作为神经元标记物的染色显示每个轴突的髓鞘明显减少。qpcr分析显示CCl11处理的共培养中髓鞘标记物mpz和mbp的表达显著降低。其他髓鞘标记物和去分化或增殖标记物没有变化，表明CCL11在髓鞘形成中的特殊作用。为了评价CCL11对Schwann细胞在体内行为的影响，我们连续向成年小鼠注射CCL11或载体（PBS），从单侧坐骨神经挤压损伤前1周开始，到损伤后4周结束；同时评价再生和对侧完整神经的再髓鞘化。我们没有观察到CCL11注射后巨噬细胞浸润行为的改变。然而，在CCL11处理的小鼠中，挤压区的MPZ信号强度趋向于较少的再髓鞘化。髓鞘碱性蛋白（MBP）免疫印迹分析显示CCL11处理小鼠的再髓鞘表达显著降低，表明再髓鞘减少。qpcr分析表明，CCL11治疗组和溶媒治疗组的坐骨神经损伤后，髓鞘标志物mRNAs（Mpz，Mbp，Egr2，Prx）显著降低。与受损神经不同，我们发现两组完整坐骨神经之间没有显著差异，这表明CCL11尤其对再髓鞘有显著作用。

 

结论：完整神经中存在的非损伤性慢性CCL11似乎使Schwann细胞进入持续的去分化非功能修复模式，损害周围神经的维持。此外，损伤诱导的CCL11存在可能损害Schwann细胞修复活性和再生过程中的成熟。我们现在已经确定CCL11是一个重要的年龄依赖性促炎性循环因子，代表了改善老年人周围神经维护和修复的一个有希望的治疗目标。