摘要：我们比较了接受均衡或过量脂肪和果糖饮食的不同等位基因型多巴胺转运体DAT敲除突变大鼠的焦虑、神经运动和认知功能。实验在纯合子DAT-/-、杂合子DAT+/-和野生型DAT+/+ 大鼠中进行。通过对DAT基因的限制性分析，与旷场试验（OF）中的行为反应进行比较，证实了DAT-KO大鼠的基因型。每个品系的第一组动物均以均衡的AIN93M饮食喂养；第二组动物以高脂肪/高果糖饮食喂养。神经运动功能通过握力试验进行研究，在升高的正迷宫和条件被动回避反应测试中评估行为反应。在实验结束时，测定了体内器官质量、白脂肪和褐色脂肪以及血浆中选定的脂质和氮代谢参数。与DAT+/-和DAT+/-相比，DAT-/-具有最高的特异握力，并显示初始探索活动增加。与第一个测试相比，DAT-/-和DAT+/-第二个测试中的探索性活动显著降低。第二组的随着年龄的增长而降低，分别是DAT+/-和DAT+/+（但在DAT-/-中没有这种情况）。DAT+/+中焦虑高于DAT+/-和DAT-/-。过量的脂肪和果糖会导致DAT+/+的短期记忆恶化。与DAT+/+相比，在DAT-/-和DAT-/+中，血浆脂质指数对饮食的反应性较差。与DAT+/+相比，DAT-/-中增加的asat/alat活性比表明突变体中分解代谢活性的激活。与DAT+/+相比，DAT-/-中增加的asat/alat活性比表明突变体中分解代谢活性的激活。过量的脂肪和果糖的摄入显著地改变了dT基因等位基因变异体产生的效应，这可能是由于对多巴胺代谢过程的影响。

 

简介：多巴胺和前脑的多巴胺能系统在食物摄入和饮食行为下的饱腹感和食物奖赏的形成中起着决定性的作用。高脂肪和高碳水化合物饮食的消耗容易导致肥胖，导致多巴胺代谢的持续变化，导致食物饱和感的形成中断。在这方面，与食物有关的行为的多巴胺能机制被认为是治疗肥胖、补充传统饮食疗法和纠正生活方式的药物干预的潜在目标。使用对多巴胺交换至关重要的基因改变的动物系是评估多巴胺能系统在食物不平衡行为反应中的作用的一种方便方法。其中一品系是DAT‐KO大鼠株，代表编码多巴胺质膜转运体（DAT）的基因敲除，负责清除神经元突触。由于这种遗传缺陷，多巴胺没有被利用，在突触间隙逐渐积累。在这些动物中，导致了运动抑制和探索性反应的消失。DAT‐KO大鼠表现出特定的行为特征，如运动活动急剧增加和持久的运动兴奋，表现为多次重复的运动反应（头部转动、四肢弯曲和伸展等）。这些表现与已知的行为转变（如抑郁）形成对照，后者是营养性肥胖的特征。因此，DAT-KO动物（缺陷基因的纯合子和杂合子）是研究高热量饮食对多巴胺能神经元介导的食物行为影响的一个有吸引力的模型。高脂肪和高碳水化合物饮食的消耗导致脂肪组织的数量增加，并随着信使（如瘦素、生长激素释放肽、脂联素和促炎和抗炎细胞因子）的产生而产生炎症反应。所有这些变化都能影响下丘脑弓状核内5-羟色胺和多巴胺能神经元的活动，与前脑高级神经元有关，负责行为反应（包括食物搜索活动和焦虑水平），以及短期和长期记忆状态。本研究的目的是比较DAT突变体和野生型肥胖大鼠的焦虑水平、神经运动和认知功能，这些大鼠的肥胖是由饮食，脂肪和果糖比例增加引起的。

 

材料和方法：研究对象是10-12周龄的雄性大鼠。DAT‐ko敲除系（DAT-/-纯合子和DAT+/-杂合子）大鼠、野生型DAT+/+ 大鼠。在旷场（OF）试验中，根据其行为反应，对基因敲除的DAT-KO纯合子和杂合子进行表型分析。在试验开始后第52天对试验动物进行重复试验。通过对实验动物进行基因分型，用聚合酶链反应（PCR）进行DAT基因DNA扩增，限制酶btsimuti消化和电泳分离，验证了实验动物的表型结果。预分型后，将动物分为6组。第一组（DAT-/-，n=4）、第三组（DAT+/-，n=12）和第五组（DAT+/+，n=8）的动物接受了基于AIN93M的对照饮食，其变化如下：（1）排除了叔丁基对苯二酚和蔗糖；（2）玉米淀粉含量为60%，而非62.5%，酪蛋白含量为20%，向日葵油含量为14%，猪油含量为10%。用偏硅酸钠代替大豆油；（3）盐混合物中偏硅酸钠的含量为0.63 g/kg，而不是1.45 g/kg；（4）在不考虑大豆油中维生素E含量的情况下，向饮食中提供维生素E。研究组接受高脂肪碳水化合物饮食（HFCD），用30%的干重脂肪代替部分淀粉和20%的果糖溶液代替饮用水。两种饮食都是随意提供的。通过测定前爪的握力，在第25天对大鼠的肌肉张力状态进行评估。通过测量两次重复的最大测功机读数（当动物与框架脱离时），以mn为单位测定握力。在第37、38和59天的被动回避条件反射（CRPA）测试中，使用Panlab Harvard设备研究了动物的短期和长期记忆指数。在训练过程中，动物最初被放在仪器的一个照亮的隔间里，背对着黑暗的隔间。在探索行为和对黑暗空间（畏光）的自然偏好的影响下，大鼠迅速进入黑暗空间。记录了在光室中停留的潜伏期（Lp）。一旦动物进入暗室，它就会受到爪子的皮肤电刺激（不超过8秒，电流0.3毫安，电阻150欧姆）。然后，立即将大鼠移到一个单独的笼子中，直到对笼子中的所有动物进行测试。训练后24小时，对动物进行重新测试，以在同一个房间内修复记忆痕迹，但没有电刺激。将大鼠放在处于起始位置的光室中，在大鼠进入暗室之前，在光室中测定LP。如果动物在180秒内没有进入暗室，人们相信记忆痕迹已经被修复。3周后用相同的程序测试记忆痕迹的保留率。采用升高的正迷宫（EPM）试验评估动物焦虑水平。该测试可以评估恐惧和焦虑的情绪反应程度、运动活动（移动性）和定向反应率。通过使用智能3.0.04视频监控系统，记录了动物在迷宫的张开臂（OAS）和闭合臂（CAS）中所花费的时间；进入CAS的延迟时间；区域间转换的次数；迷宫中穿过的路径（距离）。实验动物在迷宫中的时间是300秒。试验在喂养开始前（试验0）和喂养开始后第36天（试验I）和第57天（试验II）进行。第62天，动物乙醚麻醉后被处死。在实验室量表上测定器官、腹膜后和棕色脂肪组织的质量，准确度为±0.01g；内脏相对质量按体重的百分比计算。用加肝素的试管采集血液。通过离心分离血浆，检测生化指标（葡萄糖、甘油三酯、胆固醇等）。

 

结果：旷场试验动物表型：图一显示了一个根据其在OF试验中5分钟观察期间运动轨迹揭示大鼠基因型的例子。可以看出，DAT-/-大鼠的活动性显著增加，表现为在竞技场4区（外围）内的单向（主要是逆时针）快速移动。对于DAT+/-杂合子来说，类似的模式不太明显，表现为较小的行驶距离，在竞技场的角落出现一些停顿（延迟），伴随着站立和梳洗动作。DAT+/+大鼠的特点是场内无系统的多向运动。除了呆在4区，大鼠还多次访问3区和2区。同时，后肢运动和支架延迟的次数小于DAT+/-组。图2中的数据表明，在OF试验中第一次试验中观察到的模式在重复试验时基本相同。与DAT+/-和DAT+/-大鼠相比，DAT-/-大鼠在4区（场地外围）的行驶距离和总行驶距离最高。相反，与基因型敲除大鼠相比，DAT+/+大鼠在磁场中心（2区）的时间更多，在4区的时间更少。DAT+/-大鼠的特征是最低平均速度和最高速度（即，很明显，随着时间的推移，它们的运动更加均匀）。在比较接受或未接受HFCD的动物时，OF试验没有显著差异。例外情况是，在DAT+/+大鼠的视野边缘最大速度显著降低。例外情况是，在DAT+/+大鼠的旷场边缘最大速度显著降低。接受HFCD的DAT-/-大鼠与DAT+/-和DAT+/+动物相比，在第2区中心的时间明显减少。

 

神经运动功能检查：表1给出了每单位体重（b.w.）肌肉压缩力（前爪握力）的测定结果。肌肉压缩力是动物神经运动功能的信息特征之一。这一指标的变化既具有中心性，也表明肌肉组织中的能量代谢过程受到破坏。根据获得的数据，与DAT+/-和DAT+/+大鼠相比，DAT-/-大鼠具有更高的特异性肌肉压缩力（单位b.w.），而HFCD对该指标没有影响。

 

EPM测试中焦虑水平的评估：如图3所示，与DAT+/-大鼠相比，DAT-/-大鼠的特征是探索性活动的初始增加。这一行为表现为迷宫的OAS和CA访问次数显著增加，第一次测试期间区域间的转换总数显著增加。在重复测试期间，在DAT-/-和DAT+/-大鼠之间，对cas的访问次数和转换总数的差异保持不变。与第一次试验相比，第二次试验中所有接受HFCD的DAT+/+和DAT+/-大鼠的探索性活性均显著降低，但DAT-/-大鼠没有任何降低。结果，在第一个测试中发现的DAT-/-和DAT+/-之间的搜索活动差异在第二个测试中被平衡。大鼠的整体移动能力由迷宫中的总移动距离决定。在第二次试验中，与第一次试验相比，在DAT+/+大鼠而不是DAT+/-和DAT-/-大鼠，该指数显著降低。在这种情况下，与DAT-/-和DAT+/+大鼠相比，DAT+/-大鼠在第一次试验中的总迁移率最低。在第二次方差分析中，HFCD的消耗导致了移动性的增加，这在DAT-/-大鼠中最为明显。动物的焦虑水平是通过大鼠在迷宫的CAS和OAS中停留的时间、这些指数的比率以及与首次进入CAS的潜伏期来评估的。可以看出，在第二个试验中，当对照饮食被消耗时，在趋势水平上，与第一个试验相比，在第二个试验中，DAT+/+大鼠的焦虑降低，而在DAT-/+和DAT-/-大鼠中，没有观察到这一发现。相反，在使用HFCD的DAT+/-大鼠和DAT+/+中，但不在DAT-/-大鼠中，与第一个试验相比，第二个试验的焦虑降低。在接受HFCD的DAT+/-大鼠中，而非DAT-/-大鼠中，第二个测试中的焦虑与第一个测试相比显著降低。与对照组相比，仅在DAT+/+大鼠中，长期服用HFCD可使焦虑降低。因此，可以得出结论，根据EPM试验中的关键指标确定的焦虑水平，在DAT+/+大鼠中高于DAT+/-和DAT-/-大鼠。在HFCD消耗的背景下，与DAT-/-大鼠相比，DAT+/-大鼠受影响较小。

 

CRPA测试中短期和长期记忆指标的确定：如表2所示，在第一次试验期间（进入黑暗室后，爪电刺激后CRPA的形成），与DAT+/-和DAT+/+大鼠相比，DAT-/-大鼠的LP显著降低。这一发现与EPM试验中确定的DAT?/?大鼠的搜索活动水平增加一致。动物对HFCD的消耗导致这种影响的严重性降低。第一天后的第二次测试是短期记忆和CRPA固定程度的指标。在这项试验中，在HFCD条件下（而非对照饮食条件下），未进入暗室的动物数量在DAT+/+大鼠中明显低于DAT+/-大鼠。所获得的数据可以得出这样的结论：服用HFCD和EPM试验中显示的焦虑水平降低会导致DAT+/+大鼠的短期记忆恶化，而DAT+/-大鼠未出现。第二次试验中动物（不包括DAT+/-大鼠）的CRPA固定度不超过50%。

 

动物综合生化指标：与其他大鼠相比，DAT-/-大鼠的肝脏相对重量显著降低，大脑和性腺重量显著增加。与相应的对照组相比，食用HFCD可显著增加大鼠的肝脏重量。用HFCD治疗的DAT-/-大鼠与DAT+/+大鼠相比，心脏质量（24%）显著增加，与DAT+/-大鼠相比，肾脏（21%）显著增加。HFCD摄入导致腹膜后脂肪积聚，在DAT+/-和DAT+/+中最为明显。