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FAH基因敲除克隆小型猪的制备及繁育

2019年06月18日 浏览量: 评论(0) 来源:中国比较医学杂志2019年第5期 作者:王莎莎 朱辉斌 卢晟盛 潘登科 责任编辑:admin
摘要:供体的短缺是器官移植所面临的主要问题,制备人源化器官是解决此问题的有效途径之一。 缺乏延胡索酸乙酰乙酸水解酶(fumarylacetoacetate hydrolase,FAH)会引起遗传性酪氨酸血症Ⅰ型(hereditary tyrosinemia typeⅠ,HTⅠ),致使患者肝细胞凋亡,呈现出肝损伤。 对猪(Sus scrofa)进行基因编辑,建立FAH 基因敲 除巴马小型猪,结合人干细胞将有利于人源化干细胞肝的制备。 本研究在α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1,3galactosyltransferase,GGTA1)敲除巴马小型猪的基础上,通过 CRISPR/Cas9 技术制备 FAH 基因敲除(FAH+/-、 FAH-/-)小型猪,并分析其健康与繁育状况。

目的:供体的短缺是器官移植所面临的主要问题,制备人源化器官是解决此问题的有效途径之一。 缺乏延胡索酸乙酰乙酸水解酶(fumarylacetoacetate hydrolase,FAH)会引起遗传性酪氨酸血症Ⅰ型(hereditary tyrosinemia typeⅠ,HTⅠ),致使患者肝细胞凋亡,呈现出肝损伤。 对猪(Sus scrofa)进行基因编辑,建立FAH 基因敲 除巴马小型猪,结合人干细胞将有利于人源化干细胞肝的制备。 本研究在α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1,3galactosyltransferase,GGTA1)敲除巴马小型猪的基础上,通过 CRISPR/Cas9 技术制备 FAH 基因敲除(FAH+/-、 FAH-/-)小型猪,并分析其健康与繁育状况。

方法:针对猪 FAH 基因设计单链导向 RNA (single guide RNA, sgRNA)构建pX330表达载体转染巴马小型猪耳成纤维细胞(ear fibroblasts of Bama minipigs,BMEF)并进行敲除效 率验证,鉴定后选择阳性细胞作为核供体,通过体细胞核移植技术制备 FAH 基因敲除巴马小型猪。 提取仔猪的基 因组DNA,经PCR测序后得到突变类型;采集5月龄 FAH+/-巴马小型猪血液,检测其血生化与血常规指标并观察 肝组织学染色切片;当 FAH+/-巴马小型猪公猪性成熟后,与野生型(wildtype,WT)母猪配种,以其产仔数评价繁育 能力状况。

结果:得到了 FAH+/-巴马小型猪,Westernblot显示 FAH+/-巴马小型猪的肝和肾中FAH的表达量均有 所下降;FAH+/-猪与野生型相比,FAH+/-猪血液理化指标无显著差异;组织学切片染色发现 FAH+/-猪肝组织形态出 现空泡样变化;与 FAH+/-公猪配种的野生母猪产仔数正常;FAH+/-猪具有正常的健康状况和繁育能力。

结论:本 研究制备出了 FAH 单基因敲除小型猪,健康状况及繁育能力正常,该单基因敲除猪为将来制备出双等位基因敲除 猪与人源化肝的研究提供了良好基础。

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