省级发布专栏
您现在的位置:首页
高胆固醇血症家兔模型:胆固醇沉积对跟腱纤维结构的影响
2019年07月24日
来源:Journal of Orthopaedic Surgery and Research 2019 14:172
作者:李晓菲译
责任编辑:admin
摘要:肌腱疼痛和肌腱损伤增加是高脂血症的一个重要并发症。与粥样硬化心血管疾病中血清总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白浓度升高的发病机制不同。高脂血症在促进肌腱损伤中的作用仍有争议,需要明确。
摘要:背景:肌腱疼痛和肌腱损伤增加是高脂血症的一个重要并发症。与粥样硬化心血管疾病中血清总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白浓度升高的发病机制不同。高脂血症在促进肌腱损伤中的作用仍有争议,需要明确。
方法:在本研究中,我们分析了高胆固醇血症对跟腱胶原结构完整性的影响。对正常胆固醇(NCH)和高胆固醇(HCH)日粮喂养的兔跟腱进行了分析。我们研究了肌腱的形态、富含胶原的环境中脂质的分布、纤维胶原I和胶原III的相对含量,在宏观和纳米尺度上肌腱生物力学参数的选择。
结果:与NCH肌腱相比,HCH肌腱和腱鞘膜的组织学分析显示高细胞区,巨噬细胞数量增多,浸润肌腱结构。油红染色显示HCH肌腱中有丰富的脂质沉积,肌腱组织与胶原杂交肽(CHP)的杂交显示胶原纤维受损。变换红外光谱(FTIR)表明,存在与胆固醇酯一致的明显峰。HCH肌腱显示胶原含量低的区域与富含脂质的区域重叠。与NCH肌腱相比,HCH肌腱的胶原I与胶原III的比值增加了四倍。与对照组相比,HCH家兔的肌腱表现出较差的生物力学特性。在肌腱结构的宏观和纳米水平上,生物力学变化明显。
结论:我们的研究结果支持高胆固醇血症与肌腱减弱同时发生的假设。胶原纤维和胆固醇沉积之间的紧密接触有助于肌腱的纤维结构的弱化。
关键词:高胆固醇血症 肌腱 胶原纤维
背景:肌腱疼痛加剧和肌腱损伤是临床上与高脂血症相关的显著潜在并发症。与粥样硬化心血管疾病中血清总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白浓度升高的发病机制不同。高脂血症在促进肌腱损伤中的作用仍有争议,需要明确。对动物模型的研究表明,高脂血症与肌腱力学性能的显著变化有关。对高胆固醇血症小鼠、大鼠和猴子的冈上肌腱进行的分析显示,与对照肌腱的相应参数相比,肌腱刚度和弹性模量持续增加。其他研究表明,高胆固醇饮食对大鼠有不利影响。一项研究强调高胆固醇血症大鼠肌腱标准化硬度显著降低。小鼠高脂饮食诱导高脂血症减少髌腱的失效应力和失效负荷。肌腱损伤似乎是由多种原因引起的。例如,胆固醇副产物的积聚会损害肌腱中的血液循环。高脂血症意味着改变广泛的细胞过程,包括结构大分子的生物合成、超分子纤维组件的形成和基质金属蛋白酶(MMP)控制的基质重塑。了解高胆固醇血症与肌腱弱化的关系。我们的目的是通过在高胆固醇血症家兔模型中确定过量胆固醇对跟腱纤维结构完整性的影响。我们假设胆固醇的渗透通过一种机制削弱肌腱结构,这种机制涉及到由于胆固醇与胶原的密切接触而对胶原纤维造成损害。
方法:动物:我们从一项与动脉粥样硬化斑块形成无关的研究中获得了收集废弃肌腱的许可。除引起高胆固醇血症外,与动脉粥样硬化斑块研究相关的程序对肌腱没有任何影响。为了估计我们研究所需的家兔数量,我们考虑了发表的研究数据,这些数据是关于喂食高胆固醇饮食的家兔肌腱的机械特性,与这里应用的类似。在本研究中,作者测定了正常饮食或高胆固醇饮食的家兔冈上肌腱的负荷-失效值之间的差异。计算在类似的实验中,每组需要3只兔。我们使用的跟腱是从接受安乐死的雌性兔子获得的,这些兔子每天食用6 oz高胆固醇(1%)饮食,持续12周。含0.5%到1%胆固醇的类似饮食通常用于兔高胆固醇血症模型。在12周的高胆固醇饮食后,兔子喂食标准饮食4周,然后安乐死。对照肌腱(NCH,n=5)取自喂食相同基础饮食且不含胆固醇的兔子。HCH组平均年龄2.6岁,处死时平均体重3.4kg。NCH组平均年龄2.0岁,平均体重3.5kg。
肌腱处理:处死后,采集跟腱;一个保存用于生物力学测试,另一个肌腱来自对侧腿,用于组织切片和胶原提取。中间物质部分区域嵌入最佳切割温度化合物(OCT,组织TEK),然后在-70 C下冷冻。中间物质区域的其他部分固定在多聚甲醛中并进行组织学处理。中间物质两侧的肌腱部分被用来提取胶原蛋白。傅立叶变换红外(FTIR)光谱,3-μm厚的纵断面是从OTC嵌入样品中制备的。此外,OTC包埋切片进行油红脂质特异性染色。
肌腱组织学:对NCH(n=5)和HCH(n=5)家兔石蜡包埋标本进行苏木精和伊红染色(HE),观察肌腱结构和细胞结构。纵切面也用胶原特异性苦味酸红染色,以便分析胶原纤维束的组织。
胶原杂交肽:采用一种生物素化形式的胶原杂交肽,与胶原单α链特异性结合。CHP不能与折叠成胶原蛋白的三重螺旋的α链结合。相反,由于胶原分子的错误折叠或降解,CHP与不形成合适的三重螺旋的自由α链结合。将生物素化CHP应用于所有兔子的肌腱部分。胶原CHP结合用与亲和素结合的红色荧光团观察。此外,我们用4′,6-二氨基-2-苯吲哚(DAPI)染色细胞核,观察细胞的分布。
傅立叶变换红外光谱:用傅立叶变换红外光谱仪分析了所有肌腱样品。每只兔子准备了两个组织样本。我们平均分析了HCH组每个样本的9个感兴趣区域(ROI)(总计90个ROI)和NCH组每个样本的4.5个ROI(总计45个ROI)。我们选择HCH组的每个样本的ROI更多的原因是由于断裂和细胞浸润导致肌腱结构不均匀。与此相反,NCH组肌腱结构比较均匀,细胞含量较低。使用反射基板在反反射模式下对组织取样,测量在4000至748 cm-1波数光谱范围内的成像模式下进行,像素分辨率为25μm,每像素32次扫描,光谱分辨率为8 cm-1。为了可视化胶原特异性、蛋白特异性和脂质特异性平均吸收信号的分布和强度,生成以下标准化光谱图像.
胶原蛋白III的分析:同对照NCH家兔相比,高胆固醇饮食是否改变了HCH家兔肌腱中胶原III的相对含量。简言之,使用猪胃蛋白酶在0.5 M乙酸中以5 mg/ml的速度提取了胃蛋白酶可溶的胶原蛋白部分。用延迟还原凝胶电泳从α1(I)链中分离出α1(III)链.将相应的样品应用于分离凝胶,,在还原条件下进行电泳。
肌腱生物力学试验:安乐死后,采集跟腱,立即将其冷冻在浸泡PBS的纱布中,温度为-80°C,直至使用。最终,NCH组的4个肌腱和HCH组的3个肌腱具有足够的尺寸和质量进行试验。在机械测试之前,每个肌腱在PBS中4°C下孵育过夜。使用电动-3200材料测试系统进行机械测试。使用连接至225-N称重传感器的薄膜夹将试样两端约10 mm的区域牢牢夹紧。首先,在试样上施加0.3 N的预载。使用数字卡尺仔细测量横截面积和标距。采用0.2%/s时5%位移的正弦波形进行10个预处理循环。最后,施加0.1 mm/s的单调位移斜坡,直至失效。在25 Hz下获取力和位移,并使用自定义GNU/Octave脚本进行数字分析。
基于原子力显微镜的纳米压痕:每个OCT包埋组织沿纤维轴纵向冷冻切片到玻片上,形成5μm厚的切片。冷冻保存后,样品在OCT中-80度保存不到一周,直到AFM纳米压痕试验。仅选择完整的OCT冷冻切片进行AFM分析。因此,从NCH(n=3)和HCH家兔(n=3)中选择的肌腱进行AFM压痕研究。每只兔子准备了两个组织切片。试验前,切片在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中解冻和清洗。在每个截面上,使用微球状胶体尖端和尺寸图标AFM在10μm/s的压痕率下进行AFM纳米压痕,最大负载为120 nN。对于每个样品,我们在三个随机位置进行纳米压痕。在同一位置,至少重复三次纳米压痕,压痕曲线的高重复性表明可忽略不计的不可逆塑性变形。
结果:动物模型:生化分析显示,HCH家兔血液中胆固醇升高。NCH家兔总胆固醇浓度为10~80 mg/dl,HCH家兔总胆固醇浓度为900~1200 mg/dl。高胆固醇饮食对HCH组无不良反应。两组患者的日常活动水平相同,其体重也具有可比性。
肌腱组织学:分离后,对跟腱进行H&E染色,然后在显微镜下观察。这些观察结果显示NCH和HCH肌腱有显著差异。首先,NCH肌腱的细胞数量较低,肌腱部分可见少量的肌腱细胞。与此相反,HCH肌腱的特点是细胞的高细胞性,包括许多形态类似巨噬细胞的簇,浸润肌腱结构。腱鞘膜也是高细胞的,有明显的增生。同时,NCH肌腱腱膜厚度均匀,细胞含量较低。最后,油红染色显示HCH家兔肌腱中有富含脂质的沉积物,而与此相反,NCH肌腱中没有类似的沉积物。
肌腱组织与CHP的杂交:当完整的胶原α链折叠成紧密排列的三重螺旋时,错误折叠或断裂的α链就会展开,从而允许它们与CHP结合。将CHP应用于NCH和HCH家兔的肌腱,我们发现这种肽与肌腱富含胶原的结构结合。观察到了结合模式之间的显著差异。具体来说,在NCH肌腱中,CHP阳性信号仅在平行于肌腱纵轴的胶原纤维边缘观察到,而在HCH肌腱中,CHP特异性信号也以垂直于长轴的条带形式出现。这种独特的CHP杂交模式最有可能是在α链降解点胶原三重螺旋展开的位置。胶原特异性苦味酸红染色的HCH肌腱胶原纤维断裂的观察支持了这种结合模式。具体来说,与对照组相比,HCH肌腱中的胶原纤维连续性中断。,对苦味酸红染色样本的观察并没有发现任何明显的纤维化迹象。
肌腱的FTIR分析:由于所分析的分子具有独特的物理化学性质,我们能够利用FTIR光谱获得蛋白质特异性、胶原三螺旋特异性和脂质特异性信号。利用这些特定的信号,我们分析了总蛋白、胶原蛋白和脂质的相对数量。对HCH家兔肌腱切片的分析显示,1730 cm?1和2932 cm?1处存在明显的峰值。以往对非钙化动脉粥样硬化斑块的研究表明,这些峰值与胆固醇酯有关。我们还分析了以1560 cm?1为中心的蛋白质区和以1338 cm?1为中心的胶原区的吸收综合峰面积之比。对HCH家兔肌腱各区域的测量表明,与对照组相比,这一比率的趋势明显更高。Kim等人认为,这种变化可能意味着胶原蛋白三重螺旋结构完整性的降低。观察到,在脂肪含量较高的区域,胶原衍生信号的含量相对较低。
分析胶原蛋白III:由于纤维胶原类型的组成可能因许多病理过程而改变,我们分析了构建肌腱结构的两种主要胶原类型,即I型胶原和III型胶原的相对含量。采用一种分离胶原α链的方法,我们证明了在HCH兔中胶原III与胶原I的比率增加,这个比率增加了四倍,从NCH兔子的0.14增加到HCH兔子的0.6。
为了分析HCH(n=4)和NCH(n=3)家兔肌腱的力学性能,我们对跟腱样本进行了单一拉伸试验。观察到高胆固醇肌腱有较高的屈服应变。总的来说,我们的研究结果表明,高胆固醇显著损害肌腱的生物力学性能,其特点是强度和刚度降低,松弛度增加。我们对从HCH和NCH兔子随机选择的切片进行纳米压痕分析。与NCH对照相比,AFM纳米压痕检测到HCH肌腱的压痕模量明显较小。
结论:这项研究为胆固醇沉积与受损胶原纤维共定位提供了第一个基于FTIR和CHP的证据。这一新的迹象支持假设,即胆固醇-胶原密切接触可能是高胆固醇血症相关肌腱富含胶原框架损伤的关键因素。
上一篇:无开胸小鼠心肌梗死的微创治疗[ 08-01 ]
下一篇:广东省科学技术厅关于清远市人民医院等单位实验动物许可事项的…[ 07-19 ]
编辑信箱
欢迎您推荐或发布各类关于实验动物行业资讯、研究进展、前沿技术、学术热点、产品宣传与产业资源推广、产业分析内容以及相关评论、专题、采访、约稿等。
我要分享 >对不起,暂无资料。
热点资讯
- 年
- 月
- 周