摘要：急性心肌梗死（MI）是世界上发病率和死亡率的主要原因。传统的左冠状动脉（LCA）结扎诱导心肌梗塞的方法通常是通过一种需要开胸的侵入性方法进行的，这会导致接受此手术的动物受到严重伤害。我们试图开发一种微创方法（MIM）诱导小鼠心肌梗死。在超声引导下，对无通气和开胸的小鼠进行LCA结扎。与假手术组小鼠相比，氯化三苯基四唑染色和Masson染色检测MIM诱导的小鼠心肌梗死。. MIM手术的小鼠在术后24小时显示LVEF、LVFS、E/A和升主动脉（AAO）血流减少，S -T段和血清cTn-I水平升高。MIM诱导心肌梗死的作用与传统方法对小鼠心肌梗死的作用相当。重要的是，与传统方法相比，MIM提高了LCA结扎术后的生存率，减少了炎症。此外，与传统方法一样，MIM诱导小鼠术后28天缺血性心脏的血管生成和凋亡。最后，MIM模型可以通过一个气囊导管修改发展成心肌缺血/再灌注模型。在无通气和开胸的情况下，通过微创方法可以有效地诱导小鼠心肌梗死模型。这一新模型有可能用于研究缺血性心脏病。

 

简介：缺血性心脏病由动脉粥样硬化、高血压和血管僵硬等引起，是世界范围内的主要死亡原因。急性心肌梗死（MI）是缺血性心脏病最常见的表现形式，是发病率和死亡率的主要原因。为了了解基础医学研究中的病理生理过程和治疗策略，如硝酸盐耐受性、易损斑块、侧支动脉形成和内皮功能障碍，需要一个高效、损伤小的心肌梗死动物模型。Johns和Olson于1954年首次提出了一种基于通气的开胸术，通过结扎小鼠左主降支（LCA）建立心肌梗死模型，其中许多手术操作都是为了诱发心脏缺血事件。尽管LCA结扎仍然是最常见的缺血损伤，但其仍需采用需要通风和完全打开胸部的方法，导致广泛的组织损伤和高手术相关死亡。然而，这种方法也需要迅速打开胸腔，因为如果胸腔关闭，LCA是看不见的。开胸手术可能会造成一些创伤，不仅会增加动物疼痛和死亡，还会对全身免疫同态性产生一些有害影响，这种情况限制了与人类患者的临床相关性。在这项研究中，我们建立了一种新的方法来诱导小鼠心肌梗塞而不打开胸腔和不通气。在超声辅助下进行的该微创方法（MIM）包括LCA的识别、经胸穿刺和LCA结扎。与传统的小鼠心肌梗死诱导方法相比，新方法可降低小鼠术后死亡率和炎症反应。此外，我们还将该模型应用于小鼠缺血再灌注损伤的新模型，这表明该手术具有广泛的应用前景。

 

不开胸永久性冠状动脉闭塞方案：所有药物浓度均表示为缓冲液中的最终摩尔浓度。雄性野生型（C57BL6）小鼠，8～12周，20～25g。1、用干珠消毒器消毒手术器械。2、小鼠（一般为2-3个月大或至少18 g）吸入2%-3%异氟醚进行麻醉。3、麻醉后，将小鼠移到手术板上，用胶带固定，通过呼吸装置连续用2%异氟烷麻醉。4、用标准脱毛剂（如Nair）脱毛，用水清洗皮肤，然后用聚维酮碘和酒精消毒。为了更有效地执行此步骤，可以更早地执行脱毛。5、用剪刀在胸部左右两侧皮肤上做两个小切口（0.5厘米长），以暴露第三肋间间隙。6、进行超声心动图检查。超声心动图探头垂直于第三肋间空间内的胸部矢状面，成像左心室（LV）短轴。图1a所示为超声下的LCA。在左胸第三肋骨上缘肋角处插入一根直径为0.2毫米的小直针。当它到达LCA的下方时，我们轻轻地按压8-0丝线连接的针尖，让针尖向上移动一点。在超声波的引导下，心脏表面被直针刺穿，针头从右胸穿出皮肤。然后，从右到左将针插回原位。当针头穿过心脏时，它会在超声波的作用下通过LCA上方，从左胸的同一部位穿出皮肤。针只通过轻轻按压缝合线两侧来扩大空间，穿过胸部前壁和心脏前壁之间的空间。打一个松结，针就从左到右插回胸部。LCA现在位于绳结内部。小心拉动缝合线两端，结扎LCA。在超声波下很容易看到绳结。心电图（S-T段抬高）的典型缺血改变证实了结扎。如果MIM手术期间未观察到S-T升高，则应排除动物。假手术组除了LCA没有被阻塞外，进行同样的手术。在切口闭合后立即皮下注射丁丙诺啡（0.1 mg/kg）。用PBS和酒精清洗手术工具。

 

心电图分析：如前所述，使用电生理记录系统记录 CICAL手术前后的心电图定量。在整个CICAL和CICAL I/R过程中，还记录了超声心动图成像系统心电图的变化。简言之，在超声心动图上，将电极与三只小鼠肢体皮肤连接，以监测心电图的变化。

 

血浆cTn-I水平的测量:小鼠在手术后24小时被处死。ELISA试剂盒检测血清CTN-I水平。Microfil造影剂被注射到左心室，直到它积聚在冠状动脉中。完成后，取出灌注器官，放入多聚甲醛中数小时。图像是在徕卡M205 FC立体显微镜上获得的。手术后24小时迅速切除心脏，然后在冷PBS中清洗三次。心脏从心尖沿长轴横向切成1.0毫米厚的切片。横切面在1%的TTC的磷酸盐溶液（pH7.4）中37°C下孵育20分钟，然后转移到10%福尔马林中，在室温下孵育20分钟。图像是由普通照相机拍摄的。

 

Masson三色染色法评价心肌损伤：小鼠在心肌梗塞手术后24小时和4周被处死。心脏在室温下用4%多聚甲醛固定过夜，依次用乙醇、正丁醇脱水，石蜡包埋。纵向切片（4μm）用Masson三色染色。在全景MIDI上采集图像，并通过Image-Pro Plus软件计算心肌梗死面积。梗死面积是指所有心脏切片上梗死所占的心外膜和心内膜周长的百分比。

 

体内超声心动图测量：麻醉后，将单个小鼠置于加热垫（37°C）上，并使用带有超声心动图探头的VEVO 2100微超声系统进行超声心动图检查。利用声像分析软件计算和记录了左室射血分数和左室射血分数的百分比变化、左室射血分数的峰值速度（Vmax）、E和A峰值。

 

免疫组织化学法测定血管生成：对术后28天从小鼠收集的灌注心脏进行组织学分析。然后切开右心房，灌注心肌血管，然后用10%福尔马林灌注10分钟。心脏在4%福尔马林中固定24小时。将福尔马林固定组织嵌入石蜡中，切成4μm的切片。为了测量毛细血管密度（计数/mm2），我们进行了CD31的免疫组化分析。

 

细胞凋亡分析：用4%多聚甲醛固定组织。通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的dutp末端标记（tunel）染色评估细胞凋亡。细胞凋亡的百分比是根据TUNEL阳性细胞数除以细胞总数计算得出的。

 

结果：新型MIM成功地建立了小鼠心肌梗死模型：我们采用了新的方法来诱导心肌梗死损伤而不需要通气和开胸。为了确定这种新方法是否有效地诱导心肌梗死，我们使用microfil 血管造影对心脏和冠状动脉进行了可视化，并检查了心肌梗死的大小，如前所述。在所有用于MIM手术的63只小鼠中，2只小鼠在手术后6小时内死于LCA血管闭塞，3只小鼠被排除在外，因为在MIM手术期间未观察到S-T段抬高。我们没有观察到主要并发症，如气胸。microfil 血管造影清楚地勾勒出了LCA，用MIM手术在小鼠心脏上结扎。microfil 血管造影成像也能清楚地识别心肌梗死区域。还通过TTC染色和Masson三色染色检查心肌梗死面积。Masson三色染色定量分析表明，MIM新方法可导致小鼠显著的心肌缺血。这些结果表明，新的MIM成功地诱导了无通气和开胸的小鼠心肌梗死模型。

 

MIM术后小鼠血清CTN-I水平升高:急性心肌梗死是由缺血引起的心肌肌钙蛋白I（CTN-I）升高,因此，我们检测血清cTn－I水平，进一步证实MIM诱导心肌梗死的作用。与假手术组相比，术后24小时血清CTN-I水平明显升高，提示该方法可有效诱导小鼠心肌损伤。

 

新方法诱导小鼠心功能不全:心功能不全是导致心肌梗死患者死亡率的一个关键因素。然后，我们通过术后24小时心电图（ECG）检查心肌梗塞对MIM手术小鼠心脏功能的影响。与假手术小鼠相比，MIM手术小鼠的S-T段明显抬高。此外，MIM小鼠的LVEF 和LVFS均下降，提示新方法引起的心脏前壁运动受损。通过计算升主动脉（AAO）血流量的Vmax和E/A峰比值，确定心脏的收缩和舒张功能。与假手术后的小鼠相比，MIM手术后的小鼠AAO的Vmax和E/A峰比值均明显降低，表明该方法是诱发小鼠心脏功能障碍的有效方法。

 

MIM手术缩短了恢复时间，减少炎症:为了评价MIM手术后的损伤程度，我们比较了新方法与传统方法对小鼠术后恢复时间的影响。恢复时间定义为从手术完成到动物意识或运动恢复的时间间隔。新方法假手术组恢复时间比传统方法假手术组恢复时间明显缩短。传统的心肌梗死手术恢复时间比传统的假手术恢复时间长，但新方法假手术组同新方法MI手术组恢复时间无明显差异，提示在MIM手术中LCA结扎不会导致小鼠过度受伤。为了研究新方法引起的炎症反应，我们在术后24小时测量了TNFα和IL-6的血浆水平。与未经手术的小鼠相比，传统方法和新方法均显著提高了TNFα和IL-6的血浆水平。与假手术小鼠相比，传统的心肌梗死手术方法进一步提高了TNFα和IL-6的血浆水平，而新方法则没有。总的来说，上述数据表明，新的手术造成的组织损伤较小，手术后恢复更快。

 

MIM手术新方法诱导血管生成：MI后血管生成对于重建存活心肌的血液供应，从而恢复心脏功能至关重要。为了验证该模型是否适用于研究血管生成，我们通过分析内皮细胞的生物标志物CD31来检测血管生成。传统方法和新方法均能显著诱导心肌梗塞小鼠的血管生成，表明该方法适用于研究心肌梗塞诱导的血管生成。

 

MIM手术新方法诱导心肌细胞凋亡：研究也证实了凋亡在缺血性心脏病中的重要作用，导致心肌细胞死亡和左心室重构。为了验证该模型是否适用于心肌梗死诱导心肌细胞凋亡的研究，我们用TUNEL检测了心肌细胞凋亡。与假手术小鼠相比，传统方法和新方法均能使缺血区心肌细胞凋亡率完全升高。结果表明，MIM手术与传统的研究缺血诱导血管生成的方法一样有效。

 

新方法建立的MI模型在I/R模型中的应用：I/R模型通常用于检查缺血损伤的短期后果，并已用于研究创新心脏保护疗法的发展。在新方法基础上进行了改进建立了I/R模型。在结扎LCA之前，我们在结内放置了一个球囊导管。通过给球囊充气45分钟并连续放气3小时，我们轻轻地将球囊导管从胸部取出。伊文斯蓝加TTC染色显示缺血的AAR和左心室的梗死面积表明，MIM手术成功地在小鼠体内产生了一个I/R模型。此外，基于MIM的I/R组和传统I/R模型组的MI大小相同。结果表明，改进的MIM手术方法可用于小鼠I/R损伤的研究。

 

结论：我们有效地建立了一个无需开胸和通气的微创心肌梗死模型。这一新模型不仅适用于研究缺血诱导的血管生成和凋亡，而且进行微小的修改还可发展为I/R模型。