大规模隐性遗传筛查是一种用于鉴定生物过程基因的有效方法。这种策略在低等生物中已经成功，如酵母（酿酒酵母）和线虫（秀丽隐杆线虫）。在哺乳动物生物中，由于它们的二倍体基因组，这种功能筛选具有挑战性。RNA干扰（RNAi）目前用于通过靶向mRNA在哺乳动物细胞中进行基因组规模的功能丧失筛选;然而，这种方法通常不足以抑制基因表达，并对其他mRNA具有脱靶效应。CRISPR-Cas9系统已经应用于小鼠和人细胞中的有效功能丧失筛选。然而，迄今为止，CRISPR-Cas9介导的基因组规模筛选仅在细胞水平上使用，限制了其应用于基于细胞的表型。

 

从单性生殖或雄激素胚泡中产生哺乳动物单倍体胚胎干细胞（haESCs）为细胞水平的遗传分析提供了理想的工具。雄激素haESCs（AG-haESCs），其基因组来自精子，支持胚胎注射到成熟卵母细胞，活体动物被称为半克隆（SC）动物。此外，携带组成型表达的Cas9和单指导RNA（sgRNA）文库的DKO-AG-haESCs允许一步产生突变小鼠，显示在小鼠的生物体水平上进行功能性诱变筛选的可能性。

 

2019年7月2日，中科院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）李劲松联合邹卫国团队等人在PLOS Biology上发表题为“Targeted genetic screening in mice throughhaploid embryonic stem cells identifies critical genes in bone development”的文章，建立了一种体内遗传筛选策略，以基于ICAHCI技术和CRISPR-Cas9文库的组合应用来鉴定参与骨发育的基因。

 

研究人员使用Cas9B-3-BD细胞进行ICAHCI实验，产生突变小鼠。试图通过骨骼分析来识别骨骼发育中涉及的关键基因，这些新生SC幼崽可能覆盖69个候选基因。为了测试来自Cas9B-3-BD细胞的所得SC幼崽中的突变率，研究人员分析了3个ICAHCI实验产生的总共39个SC幼崽。sgRNA插入分析表明38只幼崽携带1个sgRNA。

 

Sanger测序的常规基因分型分析显示其中29个在sgRNA靶向位点携带突变，其中21个携带纯合或双等位基因突变，效率为55.3％，显着高于先前报道的效率30.5％（83/272）。 TIDE或胸腺嘧啶和腺嘌呤（TA）克隆分析显示，21个纯合子或双等位基因突变小鼠中有13个携带框内突变/野生型序列，总序列少于30％。同时，TIDE结果显示12只SC幼崽携带超过2种类型的等位基因，与在Runx2被靶向时的早期观察结果一致。总之，这些结果表明，使用具有靶向sgRNA文库并组成型表达Cas9的Cas9B-3-BD细胞，可以通过ICAHCI有效地产生突变小鼠。

 

通过产生突变小鼠系验证Rln1和Irx5

 

诱变筛选对于鉴定参与发育过程的关键基因是有效的。然而，这种筛选仅在低等生物中成功。该研究通过结合雄激素单倍体胚胎干细胞（AG-haESCs）和CRISPR-Cas9技术，在小鼠中开发靶向遗传筛选方法。通过卵母细胞注射携带组成型表达的Cas9的AG-haESCs和指导72个预选基因的单指导RNA（sgRNA）文库，通过骨骼筛选骨发育相关基因，制备突变半克隆（SC）小鼠库。发现了4个基因：骨骼发育所需的Zic1和Clec11a，以及之前未考虑过的Rln1和Irx5。

 

尽管Rln1 - / - 小鼠仅在出生时表现出较小的骨骼，但骨量减少和骨髓脂肪生成增加，Irx5 - / - 小鼠在出生后和成人阶段都显示出骨骼异常。IRX5通过抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）活化来促进成骨细胞生成并抑制脂肪形成。因此，AG-haESC介导的功能性诱变筛选为小鼠发育过程的遗传查询开辟了新的途径。

 

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