摘要：现在出现了一种新的治疗方法，称为生物电药物，目的以病理状态下的个别神经纤维或特定脑回路为靶点，修复功能丧失，恢复健康平衡。颈动脉窦神经（CSN）去神经支配已被证明能改善胰岛素抵抗和葡萄糖不耐受大鼠的葡萄糖稳态；然而，随着时间的推移，手术带来的这些积极影响似乎逐渐减少，严重的副作用导致化学感觉功能永久性丧失。在这里，我们描述了一种新型的生物电子应用，即千赫频率交流（KHFAC）调制，抑制啮齿动物CSN内的神经信号的能力。

 

方法：在14周内给大鼠吃杂粮或高脂肪/高蔗糖（HFHsu）饮食（60%富含脂肪的饮食加35%的蔗糖饮用水）。神经接口被双侧植入脑脊液中，并与外部脉冲发生器相连。然后将大鼠随机分为KHFAC或假调制组。通过呼吸和心脏对缺氧的反应（10%的氧气+90%的氮气）来明确KHFAC调制变量。通过ITT和OGTT的葡萄糖耐量定期评估胰岛素敏感性。

 

结果：对CSN的KHFAC调制，应用超过9周，2型糖尿病大鼠模型胰岛素敏感性和糖耐量恢复。停药后5周内胰岛素抵抗和糖耐量恢复正常。

 

结论：在2型糖尿病大鼠模型中，CSN的KHFAC调节改善了代谢控制。这些积极的结果具有重要的翻译潜力，作为一种新的治疗方式，目的是治疗人类代谢性疾病。

 

 

摘要：2型糖尿病的主要缺陷是外周胰岛素抵抗、肝葡萄糖代谢异常和进行性胰岛β细胞衰竭。2型糖尿病中的血糖控制随着时间的推移逐渐恶化，在单独饮食和运动失败后，平均每3-4年需要用降血糖剂进行一次新的干预，以获得/保持良好的控制。我们之前已经证明，通过外科切除其敏感神经来消除颈动脉体活动，颈动脉窦神经（CSN），通过重建交感神经活性，恢复高能量脂肪动物胰岛素抵抗和葡萄糖耐受模型的胰岛素敏感性和葡萄糖耐受性；这种代谢变量的重新建立与胰岛素敏感组织中胰岛素信号的恢复以及肝脏和内脏脂肪组织对葡萄糖摄取的改善有关。我们检验了抑制CSN活性是早期2型糖尿病的一种可持续治疗策略的原理证明，即通过在先前暴露于高脂肪/高蔗糖（HFHsu）饮食中14周的大鼠中双侧切除CSN来治疗早期2型糖尿病。事先知道手术切除脑脊液容易引起与周围缺氧反应丧失相关的副作用，降低对二氧化碳的敏感性，运动反应受损和血压波动，我们试图确定可逆法是否能诱导饮食诱导的早期糖尿病大鼠长期血糖控制而无明显副作用。一种新的治疗方法正在出现，这种方法可以精确检测和调节周围神经系统中的电信号模式，即生物电医学。认识到目前可用于代谢性疾病的治疗方法不能提供对该疾病的长期控制，加上显著的副作用，生物电子医学方法可通过TARG显著提高2型糖尿病的护理标准。阻断淋巴结代谢途径并避免系统性影响。此外，生物电药物可能在患者中有很高的接受度，因为它们只需要微创手术，同时对日常活动的依从性和干扰可以忽略不计。在目前的研究中，我们测试了使用双边千赫兹交流电流（KHFAC）调制来抑制CSN活性，因为这种方法已经被证明能有效地阻断体细胞神经中的神经传导。有人认为，KHFAC的作用是由于对动作电位传导的直接抑制。这是在1–100 kHz的频率范围内实现的，体内评估的最高频率为50和70 kHz。

 

手术操作：雄性SD大鼠（230-280g，年龄14-16周）。恢复试验使用Wistar?大鼠，（200-300g，8-9周龄）在恢复实验中，动物被盲法分为两组：第一组接受标准周粮，第二组接受高脂高脂饮食，在14-15周内诱发2型糖尿病（60%高脂饮食加35%饮用水蔗糖）。定期记录体重，每天监测饮食和耗水量。

 

CSN切除：分别使用ITT和OGTT评估胰岛素敏感性和葡萄糖耐量后，动物在氯胺酮（30 mg/kg）和甲苯嗪（4 mg/kg）麻醉和丁丙诺啡（10μg/kg）镇痛下接受双侧CSN横断，如前所述。对照组接受假手术（每组8-10例）。

 

CSN卡肤电极植入术：为了评价持续性KHFAC调制对CSN的影响，将1组（非疾病模型）和2组（糖尿病模型）动物植入CSN卡肤电极。大鼠急性实验用氨基甲酸乙酯（i.p.1.5 g/kg）麻醉，恢复实验用美托咪定/氯胺酮麻醉。双极卡肤电极与CSN双侧连接。纤维蛋白胶用于将卡肤固定在脑脊液上，防止电流从卡肤末端扩散。从卡肤电极引出的导线在颈部背侧皮下穿通，通过一个安装在头骨上的经皮连接器在头部外部穿通，并用环氧树脂包裹，形成一个头盖。植入后，在5赫兹和300μA的刺激下，呼吸频率增加约2 s，证实电极放置正确。使用阿替帕米唑（0.25 mg/kg，2 ml，i.p.）逆转麻醉。大鼠术后用止痛药丁丙诺啡（10μg/kg，s.c.）治疗，并用消炎卡普洛芬（5 mg/kg，s.c）治疗2-3天。动物开始KHFAC调节前恢复10天。

 

肌电图和心电图记录：用于肌电图（EMG）和心电图电极的肋间铂丝在横膈膜上皮下放置。利用Plexon多通道采集处理器数据采集系统对心电图和肌电图数据进行了差异化记录，并在Matlab中进行了分析。

 

CSN的KHFAC调制：KHFAC调制以矩形脉冲的形式应用于卡肤电极的两侧：频率为20 kHz、30 kHz、40 kHz时，电流为1 mA或频率为50 kHz，电流为2 mA。. 在经皮连接器中，来自两个卡肤的电线是平行连接的，因此电流在卡肤之间根据它们的阻抗被分开。为了确保接近等电流分裂，在植入前在生理盐水（154mmol/L NaCl）中测量卡肤电极阻抗，根据每只动物阻抗值的差异<10%，对每只动物的卡肤进行匹配。假设电流源输出等于50/50%，则每个卡肤的电流值报告为峰间值。电流源仅在0–4.2 mA（峰-峰）范围内使用，因为较高的范围在频率约为10 kHz时提供了明显的电流衰减，这是由于Keithley 6221设备在这些频率下校准不当造成的。由于没有使用电容器或电感器来补偿可能的直流（DC）偏移，因此本研究无法排除直流贡献的混淆效应。同时，输出电容器/电感器的省略避免了矩形脉冲形状的失真。记录基线呼吸频率和低氧反应（10%氧氮气），以确定KHFAC调节CSN的有效性。分别用肋间肌电图和心电图表面电极测量呼吸和心脏变量。在第2组（糖尿病模型）的动物中，测试了连续KHFAC调制对胰岛素敏感性和葡萄糖耐量的影响。CSN电极植入后，将第2组动物随机分为两组。半数动物接受连续的hhfac调节CSN 9周。在假手术组，KHFAC调节不适用于动物。为了评价KHFAC调节9周后CSN活性的可逆性，在KHFAC停止调节后5周内对动物进行胰岛素敏感性、葡萄糖耐量和通气变量的监测。

 

动物实验设计：定期（每2或3周）评估动物的空腹血糖、胰岛素敏感性和葡萄糖耐受性。手术后，第2组动物继续保持HFHsu饮食，以继续接触疾病促进因素。在几个时间点评估空腹血糖、胰岛素敏感性、葡萄糖耐量和体重。从尾静脉收集血液以量化血清介质。用戊巴比妥（60 mg/kg，i.p.）麻醉动物，测量平均动脉压（MAP）。然后通过心脏穿刺采集血液，以量化可溶性生物标志物。腹部剖腹手术后收集脂肪并称重。

 

ITT：如前所述，在清醒动物中通过ITT评估胰岛素敏感性。OGTT：葡萄糖耐量通过OGTT评估。动物禁食过夜，口服灌胃给药一剂葡萄糖（2 g/kg）。以0、15、30、60、120和180分钟为间隔，采集血样。

 

全身通气容积图记录：采用全身体积描记法测定清醒、自由活动大鼠的通气量。监测潮气量、呼吸频率和分钟通气量。方案包括让动物进行20分钟的驯化，然后是10分钟的常氧（20%氧气平衡氮气），然后是10分钟的缺氧（10%氧气平衡氮气），然后是10分钟的常氧，然后是10分钟的高碳酸（20%氧气+?5% CO2平衡氮气），然后是10分钟的常氧（20%氧气平衡氮气）。

 

生物标志物的量化：血浆胰岛素、C肽、胰高血糖素、皮质酮、一氧化氮和脂质概况：如前所述，用商用酶联免疫吸附测定试剂盒测定胰岛素和C肽浓度。用皮质酮免疫分析试剂盒检测皮质酮。如前所述，测定了所有动物的NO/NO3-水平。使用Randox试剂盒评估脂质分布。在植入后第0天和第1天以及动物死亡前测量阻抗。

 

结果：慢性双侧CSN切除对2型糖尿病动物模型的影响：我们已经证实慢性双侧CSN切除可以逆转代谢综合征大鼠的胰岛素抵抗和葡萄糖不耐受。然而，从临床角度来看，如果CSN在2型糖尿病动物模型中显示出有益的作用，那么它的调节将具有更高的影响。通过将Wistar大鼠放入HFHsu饮食中14周获得一个2型糖尿病模型。?双侧慢性CSN切除术恢复了胰岛素对基线值的敏感性。切除术后11周内保留效果。此外，CSN切除术恢复了空腹血糖并改善了葡萄糖耐受性和空腹血浆胰岛素和C肽水平。CSN切除术也使平均血压和一氧化氮水平，以及低密度脂蛋白胆固醇和三酰甘油正常化。手术干预对标准饮食喂养组的代谢和血流动力学变量没有影响。这些结果表明，在2型糖尿病模型中，双侧CSN切除可提高胰岛素敏感性和葡萄糖代谢。

 

建立抑制CSN的KHFAC参数：通过测试KHFAC对颈动脉体经典生理刺激：缺氧的影响，建立了抑制CSN活性所需的KHFAC调节参数。暴露于低氧空气（10%O2+90%N2）1分钟后，假手术组在诱导后30-60 s呼吸频率从基线水平可重复显著增加。值得注意的是，在缺氧的前30秒没有明显的差异，可能是血氧饱和度所需的时间。与假手术组相比，KHFAC治疗1分钟，显著降低了对缺氧的呼吸反应。图显示了hhfac频率与防止缺氧呼吸效应的效率之间的剂量-反应关系。30 kHz和40 kHz的频率并不能100%抑制呼吸频率。然而，在50 kHz时，低氧时的呼吸频率与基线无明显差异，表明几乎完全抑制。在20kHz时，与假水平相比，没有观察到呼吸频率的抑制。此外，在20 kHz时，前30 s出现的缺氧呼吸反应恶化明显高于假刺激，提示神经激活而不是抑制。在50 kHz和2 mA条件下，KHFAC对缺氧的心肺反应产生了最强烈的抑制作用，而没有任何心脏或呼吸反应。因此，50kHz被用于长期的KHFAC调制，以提供优越的安全性和有效性。每次应用KHFAC后，其对CSN的影响的可逆性通过对缺氧的呼吸反应的恢复得到证实。KHFAC调制对正常呼吸时的呼吸反应无影响。结果表明，在特定的频率和振幅下，特别是在1-2 mA下施加的40-50 kHz的KHFAC调制，可以抑制缺氧反应而不会引起异常的生理反应，并且观察到的效果是完全可逆的。

 

慢性KHFAC调节CSN对动物行为和通气的影响：为了评估KHFAC调制对CSN的影响，在喂食标准饮食的健康动物中，连续1周在2 mA（峰间）下施加50 kHz，未观察到任何行为改变。停止KHFAC调节后，动物暴露于低氧刺激（10%氧气平衡N2）下，在KHFAC后20分钟和1周的两个时间点评估呼吸反应。KHFAC后20分钟，动物基础通气量下降，对缺氧挑战没有反应，表明维持了功能性神经调节。在KHFAC后1周，基础通气和对缺氧的反应恢复到基线水平（呼吸频率增加约20%）。表明，清醒动物通过KHFAC调节CSN产生颈动脉体反应的抑制。低氧敏感性恢复也证明了抑制的可逆性，这表明长期应用KHFAC不会引起神经传导特性的永久性病理改变。

 

慢性KHFAC调节CSN对2型糖尿病动物模型胰岛素敏感性和葡萄糖稳态及其可逆性的影响：与预期一样，HFHsu喂养的动物具有胰岛素抵抗，并且表现出空腹胰岛素和C肽水平的增加。CSN上的电极植入对KITT和植入后2周测量的空腹胰岛素和C肽水平影响最小。此外，由OGTT测量的术后葡萄糖耐受性证实，植入术不会刺激血糖反应。

 

结论：在早期2型糖尿病的啮齿动物模型中，CSN的KHFAC调节改善了代谢控制，这种作用是持久的，尽管疾病促进因素（如高能量饮食）持续影响。KHFAC对CSN的调节作为控制CSN活性的一种手段，在治疗代谢性疾病方面具有重要的潜力。