摘要：周围神经损伤后轴突再生和功能恢复仍然是一个临床挑战。损伤导致轴突解体，之后雪旺细胞（SCS）和巨噬细胞重新参与再生过程。目前，生物材料被认为是修复周围神经损伤最有希望的方法。角蛋白作为一种天然材料，来源广泛，具有良好的生物相容性和生物降解性。用还原法从人发中提取角蛋白，经进一步加工得到具有多孔结构的角蛋白海绵。结果表明，角蛋白在体外可促进细胞粘附、增殖、迁移以及SCS分泌神经营养因子，调节巨噬细胞炎性细胞因子的表达。我们首次报道人发角蛋白能促进DRG神经元轴突的延伸。角蛋白海绵敷料减轻了坐骨神经挤压损伤引起的运动障碍。因此，角蛋白被认为是一种有价值的生物材料，可以促进周围神经再生。

 

简介：周围神经损伤逐年增多，给病人和社会带来了沉重的经济负担。损伤后修复是一个复杂而漫长的过程，在此过程中去神经雪旺细胞（SCS）去分化为一个更活跃的表型。迁移到损伤部位形成Bungner 带，然后分泌神经营养因子来滋养轴突，使轴突沿着Bungner 带延伸。巨噬细胞通过清除髓鞘碎片和表达调节局部炎症反应的各种炎症因子参与损伤后修复。迄今为止，周围神经损伤尚无有效的治疗方法，生物材料被认为是一种有前途的选择。近年来，医学再生胶原膜、聚乙醇酸和聚乳酸共聚物等多种神经修复材料得到了发展。然而，这些生物材料在人体中的应用仍然存在着各种各样的问题，包括免疫排斥、降解速度的不确定性、降解产物的毒性、材料来源有限和成本高。人发角蛋白具有良好的生物相容性、非免疫反应性、细胞间相互作用和生物降解性，被认为是促进周围神经损伤修复的优良生物材料。角蛋白的粘附序列ldv和rgd也存在于几种能够支持细胞粘附的细胞外基质蛋白中。以往的研究表明，12种细胞，如神经和骨髓干细胞，在角蛋白纳米粒制备的细胞培养膜中有明显的增殖和生长。角蛋白在一定条件下也能形成均匀的孔大小角蛋白海绵，在60℃高温下能保持数小时的形状。这一特性将角蛋白与相对低变性温度的胶原区分开来。我们假设，角蛋白在体外可以激活修复相关细胞，而制备的角蛋白海绵作为敷料可以加速坐骨神经损伤的修复。

 

人发角蛋白提取及角蛋白海绵的制备：用先前报道的方法提取人发角蛋白，并进行修改。简单地说，采用还原法提取人发角蛋白。首先，将氯仿和甲醇（2:1v/v）的混合物添加到清洁的头发中15–20min以脱脂。然后将脱毛后的毛发（10g）加入SDS（6g）、尿素（90g）和β-巯基乙醇（15ml）在300ml双蒸馏水中溶解制备的混合溶液中，在60℃下在pH7条件下反应3天。将所得混合物离心并通过滤纸过滤。然后用双蒸馏水彻底透析滤液，每6 h更换一次，直至完全去除尿素等。0.22μm过滤器过滤的角蛋白可在室温下稳定储存一年。在24孔板的每个孔中加入总共1 ml角蛋白（40 mg/ml），在-20度下冷冻3天，然后冻干，形成稳定且不溶于水的角蛋白海绵。

 

电子显微镜分析：扫描电子显微镜前，将角蛋白海绵切成1-2 mm的薄片，涂上金。首先将神经样本固定在2.5%戊二醛溶液中，在磷酸盐缓冲盐水（PBS；pH7.3）中冲洗。用1%四氧化锇固定并在一系列分级乙醇中脱水。将样品嵌入环氧丙烷中，在60℃下培养48小时。用透射电镜观察了用柠檬酸铅制备和染色的超薄切片。用IMAGEJ软件测量轴突平均髓鞘直径和髓鞘厚度。

 

角蛋白涂层：将无菌角蛋白（0.3 mg/ml）添加到培养板中，覆盖底部，然后放入37℃培养箱中进行涂层。24 h后，抽吸溶液，在井底表面留下一层薄薄的流体膜。

 

细胞培养：RSC96（大鼠雪旺细胞株）和RAW264.7细胞系在37摄氏度的添加10%FBS的DMEM中培养，并在含有5%二氧化碳的培养箱中培养，培养基每2天更换一次。

 

原代细胞培养：从出生后1-3天的SD大鼠坐骨神经中分离出原发性SCS。细胞在涂有聚赖氨酸的培养板上培养24h，然后用阿糖胞苷（10μM）进一步纯化48h。本实验使用p3-p8初级SCS。简单地说，从三天大的SD大鼠身上获得背根神经节（DRG）。将分离的神经节在3 mg/ml胶原酶A中培养30 min，37 ℃，中和离心后加入0.25%胰蛋白酶30 min。最后，将单个DRG分为两组进行24小时培养。

 

细胞粘附试验：在75 mm低粘聚乙烯板的右侧涂上角蛋白。然后加入5×107 RSC96细胞，置于37℃培养箱中，24h后观察细胞在两侧的粘附情况。为了进一步测试粘附率，将6×105 RSC96细胞添加到涂层和未涂层的标准聚苯乙烯24孔板中。在接种后6 h内，两组每小时计算未附着细胞数。

 

细胞增殖测定：将细胞接种在有涂层和无涂层的96孔板（3000个细胞/孔）上，补充1%FBS。用细胞计数试剂盒-8评估第1、3、5和7天的细胞增殖。在450 nm处测量吸光度。5×106 RSC96细胞接种在有涂层和无涂层的6孔板上，辅以10%FBS，持续1天、3天、5天和7天。然后根据制造商的说明，用苏木精和伊红（HE）试剂盒对细胞进行染色。用直立显微镜收集图像。

 

细胞迁移分析：将具有10%FBS的DMEM（600uL）添加到涂层和未涂层的孔下层。将5×104的原代SCs血清游离细胞悬液（200μL）加入孔上层，培养12 h。用4%多聚甲醛去除固定30分钟，用PBS洗涤三次后用结晶紫染色。在直立显微镜下对染色细胞进行成像和计数。在伤口愈合试验中，将5_×104初级SCS接种在有涂层和无涂层的24孔板上。将细胞生长至单层，血清饥饿12小时，然后用无菌10 uL吸管尖形成线性划痕，将24孔板的培养基立即更换为无血清培养基。伤后0、12小时用倒置显微镜对划痕部位进行拍照。

 

免疫荧光染色：用4%多聚甲醛固定DRG神经元20 min，用PBS洗涤3次每次5 min。将2%牛血清白蛋白（BSA）和0.1%的TrITO-X100（PBS）分别在37℃、2℃的条件下加入到各孔中进行渗透和培养。用一级抗体兔抗βIII微管蛋白（1:300）孵育DRG神经元，4℃孵育过夜。第二天，DRG神经元在37摄氏度条件下，用CYTM3共轭山羊抗兔IgG（H+L）（1:600）孵育2 h。倒置荧光显微镜下观察DRG神经元。

 

大鼠坐骨神经挤压损伤模型：将体重180–200g的雄性SD大鼠置于无菌环境中。12只SD大鼠随机分为两组（每组6只）：（1）对照组和（2）角蛋白组。戊巴比妥（50 mg/kg）腹腔内注射完全麻醉动物，用钝性肌肉分离法分离臀肌，暴露右侧坐骨神经。用止血钳将神经中段紧紧挤压30 s，直至其颜色变为半透明。将制备好的角蛋白海绵包裹在受损神经周围，伤口分层闭合。坐骨神经功能指数：计算坐骨神经功能指数（SFI），并在术后3、7、14、17和21天对SD大鼠进行足迹分析，以评估后肢功能恢复情况。后肢涂上了无毒的手指涂料，走在跑道上收集至少五个可测量的脚印。分别测量正常侧（N）和实验侧（E），相关参数如下：足底全长（PI）、第一趾至第五趾的距离、脚趾伸展（TS）、第二趾至第四趾的距离和中间趾伸展（IT）根据以下公式计算SFI：SFI反映了周围神经的恢复。评分为-100表示功能完全丧失，而0表示有效神经。

 

结果：角蛋白的生物学特性：还原法提取的角蛋白多为α-角蛋白，主要由分子量在40-60kDa之间的微纤丝角蛋白组成。RSC96细胞仅粘附在预涂低粘附板的右侧，提示角蛋白具有良好的细胞相容性。为了评估接种效率，两组同时接种RSC96细胞。前2 h，角蛋白组细胞黏附迅速（约70.8%），对照组仅黏附约44.8%。随着贴壁时间的延长，4 h后差异逐渐减小，6 h时两组细胞完全贴壁。这表明角蛋白有助于细胞粘附。除粘附率的变化外，角蛋白组RSC96细胞的形态在接种后12小时开始发生变化。圆形细胞数量减少，大部分变成典型的梭形、纺锤形形态。这种现象在原发性SCS中更为明显，角蛋白组原发性SCS在种植24小时后出现较长的神经丝，并形成相互接触的环状。角蛋白组的细胞环数目在72小时时比对照组增加。

 

角蛋白对SCS和DRG的影响：与对照组相比，角蛋白组第5天和第7天RSC96细胞增殖明显增加。由于角蛋白对不同细胞的亲和力不同，角蛋白组的原发性SCS在3天后开始增殖。HE染色观察表明，第5天角蛋白组的RSC96细胞的细胞间隙减小，第7天细胞相互堆积形成更多的菌落。但这一现象在对照组并不明显。刺激12 h后，角蛋白组穿孔细胞数约为对照组的两倍。在伤口愈合实验中也观察到了类似的结果，表明角蛋白组受损区域在12小时后显著减少。SCS分泌的神经营养因子在轴突再生中起重要作用。角蛋白组第一天GDNF、NGF和CNTF的mRNA水平明显高于对照组。随着时间的延长，神经营养因子的分泌逐渐减少，但GDNF、NGF和CNTF的水平仍高于对照组。轴突特异性标记物βIII微管蛋白免疫荧光染色检测DRG神经元的生长。角蛋白组轴突移植24小时后，神经丝的密度和长度远优于对照组。提示角蛋白通过激活SCS间接参与损伤修复，但直接促进轴突的延伸。

 

坐骨神经修复：为了进一步探讨角蛋白在体内对周围神经损伤的修复作用，我们将角蛋白加工成一个孔径为200um的网状角蛋白海绵。如流程图所示，在坐骨神经挤压后，将角蛋白海绵包裹在损伤部位周围。术后第四周观察到角蛋白海绵约一半被吸收，5周内完全降解。角蛋白组的足迹在10天时延伸，在21天时接近正常肢体的足迹。对照组足印在第13天开始改变，21天后恢复率低于角蛋白组。坐骨神经挤压损伤后，3天后，对照组和角蛋白组的SFI值分别下降至-79.2和-74.2，表明坐骨神经功能丧失。17天后，角蛋白组的功能改善（-27.7）明显高于对照组（-45.9），21天后差异更为明显。与角蛋白组相比，长期去神经导致腓肠肌萎缩，损伤后第3周对照组腓肠肌湿重和肌纤维直径明显下降。用透射电镜观察正常神经组、对照组和角蛋白组远端再生神经的髓鞘形态。角蛋白组在轴突直径和厚度上优于对照组。

 

结论：周围神经损伤后的修复与再生是一个复杂的过程。角蛋白作为一种天然的生物材料，可以调节多种细胞的生物活性，稳定受损部位的微环境，促进轴突的再生。因此，角蛋白对细胞培养和组织修复都具有良好的促进作用，但其潜在的调控机制有待进一步探讨。