摘要：干眼病导致数百万患者的不适和疼痛。使用小鼠急性干燥应激（DS）模型，我们发现DS诱导上皮内角膜神经（ICN）密度降低、角膜敏感度降低，使用小鼠急性干燥应激（DS）模型，我们发现DS诱导上皮内角膜神经（ICN）密度降低，角膜敏感度降低，以及从基底神经（SBN）分支的上皮内神经末梢（INTs）的顶端延长。局部应用0.02%丝裂霉素C（MMC）或单独使用赋形剂对急性DS所致轴突密度的总体损失没有影响。慢性干眼症随着C57BL/6小鼠年龄的增长而逐渐发展，在2个月至24个月之间，伴随着ICN和角膜敏感度显著降低。qPCR研究表明，调节轴突生长和延伸的几种蛋白质的mRNAs在24月龄时在角膜上皮细胞中减少，但调节吞噬和自噬的蛋白质没有改变。综上所述，这些数据表明干眼症伴有上皮内感觉神经形态和功能的改变，以及编码轴突延伸基因的mRNAs角膜上皮细胞表达的降低。采用小鼠干眼症急性和慢性模型，观察干眼症对角膜上皮内神经（ICN）和角膜上皮细胞的病理影响。数据显示，干眼诱导的病理过程中，感觉神经数量减少，神经形态、敏感性、角膜上皮细胞增殖和调节轴突延长的蛋白质mRNAs表达发生改变。

 

 

简介：角膜由密集的感觉轴突（称为上皮内角膜神经（ICN））支配，这些轴突由两个部分组成：：由角膜上皮基底细胞和上皮内神经末梢（INTs）包裹的基底神经（SBNs），这些末梢从SBNs分支并垂直延伸至顶端鳞片。在正常小鼠角膜中，一些研究小组报告了交感神经，而另一些研究小组在单纯疱疹病毒感染后才发现了小鼠角膜中的交感神经。ICN作为热感受器和伤害感受器发挥作用，引起眨眼和泪液在眼表面扩散。ICN的神经细胞体位于三叉神经节内。当三叉神经节受损或大部分ICN被切断时，角膜敏感性丧失，角膜上皮细胞侵蚀，基质变浑浊，上皮细胞停止增殖。ICN对维持眼表健康至关重要。成像技术的进步使得用共聚焦显微镜在小鼠角膜上获取ICN的高分辨率图像成为可能。同样，体内共聚焦显微镜的研究进展允许对人角膜中的ICN进行研究。研究小纤维神经病变和影响中枢神经系统的疾病（包括多发性硬化症、帕金森病和纤维肌痛）的临床医师报告了角膜感觉神经的形态和数量的改变。体内角膜共聚焦成像已被提出作为诊断这些疾病的早期阶段和跟踪患者对治疗的反应的一种方法。ICN与干眼症相关的不适有关。由于泪液体积或质量的减少，眼睑和角膜之间的摩擦增大，可能会引起疼痛，炎症会加剧疼痛。干眼病引起的不适在某些患者中表现为眼部小纤维神经病。利用慢性和急性小鼠模型研究干眼症及其进展，我们对干眼症的理解取得了进展。基因工程小鼠被认为是慢性干眼症的模型，包括Aire小鼠和Langerin缺陷小鼠。局部应用苯扎氯铵在遗传正常小鼠眼表可诱导干眼。使C57BL/6小鼠衰老与慢性干眼病症状的发生有关，这种症状类似于幼龄小鼠在急性诱发干眼病的治疗中出现的症状。据报道，C57BL/6小鼠的感觉轴突密度降低。最近的一项研究表明，在切除泪腺的慢性干眼手术模型中，感觉轴突密度降低。在目前的研究中，我们评估了急性DS和老化对ICN密度、厚度和敏感性的影响，以及ICN轴突向上皮表面顶端延伸的能力。此外，我们还评估了局部应用0.02%丝裂霉素C或单独载体（PBS）对急性DS小鼠C57BL/6轴突密度的影响。在青光眼和屈光手术中，局部应用MMC（0.02%），以减少疤痕。使用BALB/C小鼠复发性上皮糜烂模型，我们发现在1.5 mm清创损伤后3天和7天局部应用MMC（0.02%）可显著提高糜烂的分辨率和轴突密度。局部MMC治疗对干眼症患者ICN密度的影响尚不清楚。考虑到数百万患有干眼症的患者以及局部应用MMC的大量眼科应用，我们还评估了MMC对急性DS小鼠C57BL/6轴突密度的影响。

 

动物：购买6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠。通过皮下注射氢溴酸东莨菪碱（0.5 mg/0.2 ml）、QID（08:00、12:00、14:00和17:00 h）在6-8周大的雌性C57BL/6小鼠中连续3、5或10天诱导DS，并在每个变量（DS3、DS5和DS10）结束时进行安乐死，如先前发表的那样。由于干眼在女性中更为普遍，而雄性小鼠对干燥反应不佳，因此只使用雌性小鼠。

 

局部治疗方案:小鼠（DS5和DS10）在DS开始后的第一天和第三天分别接受丝裂霉素C（0.02%）、2μl/眼）或赋形剂（平衡盐溶液、BSS）的局部应用。

 

角膜机械敏感性：仅在每只小鼠的右眼使用改良的cochet-bonet在手术室下测量角膜敏感度。标准的cochet-bonet尼龙长丝直径为0.12 mm；我们使用直径为0.03 mm的9-0尼龙来补偿小鼠角膜比人类更小和更薄的部分。尼龙单丝被切割成不同的长度（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 cm）。拿着动物的时候，尼龙丝被贴在角膜上，一个明显的刺激-诱发眨眼和眼球回缩到眼眶，显示出积极的反应。中央角膜在每个细丝长度上测试6次。当单丝触摸没有引起眨眼时，反应被认为是阴性。当动物眨眼次数大于或等于试验次数的50%时，认为有阳性反应。如果单丝长度为1.0 cm时不能引起眨眼反应，则角膜敏感度记录为0。

 

衰老研究：自然老化的雌雄C57BL/6小鼠在特定的无病原环境中生存，并在24个月龄时使用。只使用没有可见角膜病理学的小鼠。除非另有说明，否则使用雄性和雌性小鼠。

 

角膜不规则性的评估:如前所述，对年轻和老年的C57BL/6小鼠（n=12只动物/组）的角膜表面不规则性进行评估。安乐死后立即从立体变焦显微镜（SMZ 1500；Nikon）的光纤环形照明器中拍摄白色环形的反射图像。这种环形光牢固地附着在显微镜物镜的底部周围。?由于光路几乎与显微镜光轴一致，因此观察区域照明均匀，几乎无阴影。投影环光将从湿表面反射，反射环的规则性取决于表面的光滑度。在数字图像中，用掩模观测器对反射环的平滑度进行分级。投影环被分为四个象限，每个象限3个时钟小时。根据反射环中扭曲象限的数量，采用5点量表计算角膜不规则程度评分。0，无失真；1，环的一个象限失真（3个时钟小时）；2，两个象限失真（6个时钟小时）；3，三个象限失真（9个时钟小时）；4，四个象限失真（12个时钟小时）；5，严重失真，无法识别环。取12只幼鼠和12只老年小鼠的角膜不规则程度评分。

 

免疫荧光:小鼠角膜的固定和染色用于上皮内神经末梢的识别已在前面进行过描述。 角膜用βIII微管蛋白和/或Ki67在4℃孵育。

 

结果：轴突密度和厚度因急性DS而降低:如前所述，在8周大的C57BL/6小鼠中使用胆碱能受体阻滞剂（东莨菪碱）和低湿度通风环境急性诱导DS。东莨菪碱治疗开始后，在D1和D3处局部应用MMC（0.02%）或赋形剂（PBS）。在D3接受安乐死的小鼠角膜未经MMC或赋形剂治疗。正常饲养未经处理的小鼠用作对照组。每个角膜的轴突密度在开始DS后3、5和10天显示为红色（对照组）或黑色（DS）填充圆。三个D5和D10亚组[无治疗（---）、赋形剂（veh）和经MMC治疗（MMC）]的数据单独呈现，并在合并后增加评估的统计能力。与对照组相比，在MMC处理后D5和在赋形剂（veh）和MMC处理后D10轴突密度显著降低。当用Kruskal-Wallis多重比较试验比较三个D5和D10亚组的轴突密度数据时，两个时间点的亚组之间没有显著差异。将亚组轴突密度数据合并为一组，包括38（D5）和30（D10）只小鼠。轴突密度D5显著降低，在D10仍保持下降。与对照组相比，在D5和D10时轴突平均厚度减小。用于量化轴突密度的方法使用平投影共聚焦图像堆栈，不允许评估上皮内神经末梢（INTs）。为了观察尖部Int延伸，我们为每个变量获得3到5个角膜的高分辨率共聚焦图像堆栈，生成3D图像，并旋转它们以生成穿过135μm角膜组织的横截面图。通过量化平行于基底细胞层的两个区域的像素强度值来评估Int密度；一条线位于基底神经垫上方，另一条线位于最顶端细胞层下方。急性DS诱导后，在d3的基底和顶端区域内，INTs的密度降低；轴突顶端投射的减少持续存在，在D5时变得更大，到D10时，基底神经向角膜上皮最顶端的延伸减少了70-80%。接下来，用Ki67染色来评估对照组和DS组角膜上皮细胞增殖是否存在差异。在评估的任何时间点，每个区域的Ki67+细胞数量均无显著差异。

 

用角膜接触阈值评估的角膜敏感性在诱导急性DS后3天内丧失：当图1c所示的轴索密度在D10处的整体降低小于20%时，这些轴索顶端到眼表面的投影减少了70-80%，如图2c所示。与在基底细胞层上皮深层终止的轴突相比，在寒冷或机械刺激下终止于最顶端鳞片下方的轴突首先去极化。为了确定感觉神经的形态差异是否影响神经功能，我们接下来使用方法一节中描述的修改的 Cochet-Bonnet感觉计来确定角膜接触阈值来评估灵敏度。这项评估包括将不同长度的尼龙细丝接触角膜表面并评估眨眼反应。数据如图3所示，结果表明：DS发生后，角膜接触阈值在D3处消失，在D10处保持抑制状态。注射东莨菪碱但不受气流或低湿度影响的小鼠角膜接触阈值没有降低。在DS启动后的d3中，角膜接触阈值被消除，尽管d3处神经末梢的顶端延伸减少小于30%，并且轴突总密度没有显著降低。

 

老年小鼠眼表面粗糙度增加，上皮内角膜轴突密度降低：15-24月龄雌性C57BL/6小鼠角膜有干眼症的迹象，表现为OGD角膜染色增强，反射环的结膜杯状细胞密度和角膜表面不规则性降低。为了证实我们以前的发现，我们显示了2个月和24个月大的小鼠的角膜表面不规则评分。数据证实，随着年龄增长，角膜表面不规则性增加，这与先前的研究一致。为了确定小鼠的感觉神经是否随着年龄的增长而发生变化，我们将6-8周龄小鼠的轴突密度与20-24月龄小鼠的轴突密度进行了比较。图4b中的代表性图像显示24个月大的小鼠的角膜；与图1a中8周大的对照小鼠角膜的数据相比，看到的轴突更少，看起来更薄，经常被破坏。图4c显示了1.5-2.0和20-24月龄小鼠轴突密度数据的定量，表明20-24月龄小鼠轴突密度下降了～75%。当我们评估轴突厚度时，我们发现随着年龄的增长没有变化。还评估了上皮内轴突末端定位于最顶端细胞层的能力。我们发现轴突的延伸随着年龄的增长而保持，并在基底细胞层内增加。虽然数量少得多，但保留24个月的轴突能够定位于角膜顶端。

 

24月龄小鼠大多数角膜的角膜敏感性都会降低，细胞增殖也会减少：24月龄小鼠的角膜接触阈值评估显示其敏感度明显下降，16只角膜中有12只对尼龙丝没有反应。此外，还评估了轴突密度的降低和老化对角膜上皮细胞增殖的敏感性的影响。我们观察到1.5-2.0月和24月龄小鼠角膜上皮细胞增殖显著降低。虽然轴突保留在顶端表面24个月，但它们不支持正常的感觉或角膜上皮细胞增殖。

 

年龄诱导的干眼症伴随着调节轴突生长和靶向的mRNAs编码蛋白的表达减少，编码抑制轴突生长的蛋白质的mRNA的靶向性和表达增加：在24月龄小鼠角膜中轴突数量的减少可能是继发于许多因素。这可能是由于较老的脱落轴突碎片的角膜上皮细胞的更替和吞噬增加，调节轴突延伸和靶向的蛋白质的mRNAs表达减少，或排斥轴突的蛋白质表达增加所致。为了研究老年小鼠轴突缺失的机制，采用清创法采集6-8周龄和24个月龄小鼠的角膜上皮并分离RNA。qPCR研究使用mRNAs的引物进行，其表达与吞噬和自噬增加以及与轴突靶向和延伸相关的mRNAs引物相关。我们发现24个月的表达与6-8周相比没有显著差异，在吞噬和自噬增加的细胞中，beclin1、lc3、lamp1和lamp2的mRNAs表达上调。相比之下，在介导轴突靶向性的mRNAs中，4个正向调节轴突靶向性的表达在24月龄减少，包括内毒素1及其受体DCC、UNC5B和EFNA5。综上所述，这些数据表明，老化导致上皮内角膜神经数量减少和敏感性降低，部分原因是诱导轴突生长的蛋白质在角膜上皮细胞中的表达减少，以及抑制轴突生长的蛋白质的表达增加。虽然轴突较少，但那些持续存在的轴突仍保留着其顶端定位的能力。

 

结论：我们发现急性DS小鼠的角膜轴突密度降低，而在以前被证明患有慢性干眼症的老年小鼠的角膜轴突密度也降低。急性DS发病后及衰老后感觉轴突形态及数量的变化伴随着角膜接触阈丧失。