摘要：背景：斑马鱼最近被证明是研究包括骨质疏松症在内的骨骼疾病的理想模型。糖皮质激素联合化学染色可诱导斑马鱼骨质疏松模型，反映骨矿化程度。然而，这种方法是不稳定的。在这里，我们开发了一种新的方法来直接评估骨质量和密度。

 

方法：我们利用转基因斑马鱼TG（ola.sp7:nlsGFP）的骨骼，通过测量增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的面积和积分光密度（IOD）来评估骨质量和密度。该方法与传统的化学染色方法进行了进一步的比较，显示了骨矿化。此外，通过定量逆转录-聚合酶链反应（qrt-PCR）分析与斑马鱼骨质疏松症相关的基因。

 

结果：在糖皮质激素诱导或淫羊霍黄酮（FE）挽救治疗后。对mRNA水平的qRT-PCR分析显示，糖皮质激素通过下调成骨细胞相关因子Osterix、骨钙素和骨桥蛋白的表达，以及上调破骨细胞相关因子酒石酸盐抗性酸性磷酸酶的表达来诱导骨质疏松症。在FE挽救的鱼类中，成骨因子Osterix、骨钙素和骨桥蛋白的表达增加。

 

结论：与传统的化学染色方法相比，利用TG（ola.sp7:nlsGFP）建立的新的骨质疏松模型在体内研究骨质疏松症更为方便和有效，特别是在高通量抗骨质疏松药物筛选方面。

 

简介：骨质疏松症（OP）是一种退行性骨疾病，其特征是骨质量减少、骨微结构退化和骨折风险增加。OP的发病机制与骨代谢不平衡有关，包括破骨细胞和成骨细胞分别调节的对骨形成和骨吸收过程的破坏。当骨形成率低于骨吸收率时，OP起作用。治疗OP的药物包括骨吸收抑制剂和骨形成增强剂。骨吸收抑制剂是最大的药物类别，包括双磷酸盐、激素替代疗法（HRT）、选择性雌激素受体调节剂（SERMS）、降钙素和RANK配体抑制剂。这些治疗通过抑制骨吸收来增加骨密度（BMD）。骨形成增强剂直接刺激骨形成，促进成骨细胞生成胶原和骨基质。许多中药或化合物在这些过程、体外研究和活体大鼠中都有一定的疗效，包括所谓的六味地黄、淫羊霍、丹参。疾病模型对药物的研究和开发非常重要。然而，细胞模型过于简单化，不能准确反映整体生理学，也不能提供体内药物代谢的大量信息。小鼠等动物模型的成本和时间劣势限制了其在高通量筛选中的应用。相比之下，斑马鱼有几个优势，包括它们的快速发展和小，透明的身体。此外，斑马鱼和哺乳动物之间的发育信号通路和相关基因高度保守。脊椎动物的骨骼发育机制在进化上是保守的。与成骨细胞发育相关的主要途径包括Wnt/β-连环蛋白、TGF-β和Hedgehog信号。与哺乳动物大体相似，低等脊椎动物的骨形成也具有由一系列转录因子和激素控制的软骨内和膜内骨化。参与斑马鱼骨形成的关键调节因子包括与人类骨形成调节因子同源的Osterix、Runx2a/b、Col10a1和骨连素。总的来说，这些常见的发育特征为利用斑马鱼作为成熟骨骼疾病的研究模型提供了理论依据。利用组织特异性启动子下游的报告基因的转基因技术可用于在特定器官中产生荧光。这项技术已被用于斑马鱼的分子水平上的基因功能研究以及药物筛选。表达增强绿色荧光蛋白（eGFP）的转基因斑马鱼TG（ola.sp7:nlsGFP）已经被研究者用来研究轴向骨骼的发育。接受各种糖皮质激素治疗的患者有时会出现OP副作用。在大多数脊椎动物中，包括哺乳动物，糖皮质激素系统是高度保守的。同样的症状也可以在小鼠身上引起。糖皮质激素也被用于斑马鱼，以引起类似OP的症状，并建立一个OP模型。用槲皮素和茜素红进行化学染色是骨研究中常用的方法。用能与钙离子螯合的茜素红染色是斑马鱼骨矿化最常用的可视化方法。但是，这种方法有缺点，包括繁琐的技术程序（需要染色和使用多种试剂）、耗时（漫长的染色和漂白过程）、不稳定的染料标记（茜素红并不总是能够按要求在鱼体内传播）。在本研究中，我们试图建立一个糖皮质激素诱导的OP（GIOP）模型，并利用骨转基因斑马鱼TG（ola.sp7:nlsGFP）建立其评估方案。测量EGFP信号面积和积分光密度（IOD），分别反映骨矿化面积和骨密度。该方法具有方便、高效、稳定等优点，为抗OP药物的高通量筛选提供了强有力的工具。

 

斑马鱼养殖：胚胎和幼虫在28.5°C下，胚胎水的（5 mM Nacl，0.17 mM KCl，0.33 mM CaCl2，0.33 mM MgSO4）培养箱中培养。转基因斑马鱼：如前所述，利用Tol2转座子系统产生TG（ola.sp7:nlsGFP）转基因斑马鱼。Schulte-Merker实验室提供pDestTol2cG2-osterix-nlseGFP-PA质粒。.通过将其与野生型斑马鱼杂交并筛选表达EGFP的F1代胚胎来鉴定。本研究在同一组实验中使用了表达强EGFP的同一对成鱼的纯合子胚胎。

 

诱导斑马鱼骨质疏松模型：野生型或转基因幼虫在受精后4天（DPF）在12孔培养板中培养。在胚胎水中加入N-苯基硫脲以防止色素沉淀。为了建立GIOP模型，将胚胎暴露于5、10和20μm浓度的地塞米松中，以选择最佳有效浓度。在挽救实验中，以FE，纯度>90%提取的1.0、0.5和0.1μg/ml的黄酮类化合物与10μN DEX混合，选择最佳有效浓度。以DMSO（1:1000）和纯胚胎水为对照组。每天（使用DEX和/或铁）更新一半体积的胚胎水。所有试验在第五天结束，采集8条DPF鱼进行骨矿化分析。每组18个胚胎。

 

qRT‐PCR：每组共取15条8 dpf的鱼qu进行qrt-PCR分析。用 Trizol 分离总RNA，用DNA酶I处理。根据制造商的说明，使用SYBR绿色实时PCR主混合物合成cDNA时需要1000ng RNA.。将所得cDNA在DEPC处理水中稀释1:10进行进一步实验。qrt-PCR反应的总体积为20μl，包含10μl 2×sybr绿色实时PCR主混合物、5μl稀释cDNA、0.8μl引物和DEPC处理水。本实验所用的引物为：osterix‐Fw AAGAAACCTGTCCACAGCTG; osterix‐Re GAGGCTTTACCGTACACCTT; osteocalcin‐Fw TGGCCTCTATCATCATGAGACAGA; osteocalcin‐Re CTCTCGAGCTGAAATGGAGTCA; eGFP‐Fw GAAGAACGGCATCAAGGTG, eGFP‐Re ACTGGGTGCTCAGGTAGTGG; osteopontin‐Fw CGCTCAGCAAGCAGTTCAGA; osteopontin‐Re AGAATAGGAGGTGGCCGTTGA;tracp‐Fw CGTCCACTGACCACAGGAAGA,tracp‐Re AAGGATCCTGACGTCTGATTGA; β‐actin‐Fw CAACAGGGAAAAGATGACACAGAT; and β‐actin‐Re CAGCCTGGATGGCAACGT.

 

骨矿化的成像与评价：斑马鱼幼虫固定在4%多聚甲醛（PFA）磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。如前所述，斑马鱼幼虫用茜素红染色。用M205-FA立体显微镜对胚胎进行植入和成像。每个成像过程的增益、饱和度、曝光和照明水平都是相同的。用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）对转基因斑马鱼TG（ola.sp7:nlsGFP）进行三维重建。在所有鱼群的所有成像过程中，LSCM成像参数设置相同。针孔设置为1 AU，数字增益设置为1.0；主增益和数字偏移均设置为最低，以避免过度曝光。Z叠层和内部深度设置采用了优化的剖切深度。根据三维重建图像评估骨矿化，并使用Image‐Pro软件进行量化。在密度和IOD的测量过程中，滴管工具被用来反复精确地选择感兴趣的区域（ROI），直到所有的ROI都被选中。对于野生型鱼类，如前所述测量茜素红染色区域。对于转基因鱼，荧光图像首先被反转为灰度图像。然后，用与茜素红染色胚胎相同的方法测量荧光区和IOD，分别代表矿化程度和BMD。在计算信号强度时，采用“测量数据”和“统计”函数对IOD结果进行t检验。每组18个胚胎。

 

结果：TG（ola.sp7:nlsGFP）斑马鱼中DEX诱导的骨质疏松样症状：为了产生皮质骨转基因斑马鱼，将pdesttol2c2-Osterix-nlseGFP-pa载体注射到AB斑马鱼胚胎中。在TG（ola.sp7:nlsGFP）斑马鱼的一系列发育阶段研究了标记成骨细胞的eGFP的表达模式。最初在1 DPF胚胎的头部和尾部区域检测到EGFP。在8 dpf时，在唇裂（CT）、盖层、下颌骨（MD）和鳃裂（BR）中可以清楚地看到eGFP。从30到42 dpf，eGFP强烈标记了头侧骨骼、脊柱、鳍、尾和鳞片。头骨发育在4到8 dpf之间。在此期间，头骨的结构和形态没有发生明显的变化。在这些发育阶段，骨质量和骨密度均无明显变化，分别反映在eGFP荧光区和IOD中。因此，本研究采用4～8dpf的斑马鱼幼虫。茜素红与钙离子螯合，标记矿化骨，是研究骨矿化最常用的方法。在比较这两种方法的早期骨结构时，有明显的差异，特别是在前脊索区，其用茜素红染色清晰，但在8 dpf时仍无标记。为了诱发OP样症状，对4 DPF斑马鱼幼虫给予不同浓度的DEX。形态学上，单纯水孵胚和DMSO孵育斑马鱼幼虫之间无显著性差异。在8 dpf时，与未治疗或DMSO治疗的对照组相比，用5μM DEX治疗的斑马鱼在大脑和躯干的连接区域显示出轻微的曲线。DEX浓度从10μm增加到20μm，加重了这种表现。通过形态计量学比较头侧骨图像时，所有处理过的胚胎在茜素红染色组和TG（ola.sp7:nlsGFP）组中呈现出相似的结构。然而，DEX处理的幼虫的信号强度在茜素红染色和绿色荧光上均呈现下降趋势。在这两组中，暴露于5μM DEX的幼虫的矿化面积明显低于DMSO处理的幼虫。将浓度增加到10或20μm进一步增强了这一差异。以上结果表明，以EGFP面积和IOD为参数的评价方法可以反映骨质量损失水平。结果与传统的茜素红染色结果一致，提示用TG（ola.sp7:nlsGFP）线成功地建立了斑马鱼GIOP模型。

 

类黄酮治疗能挽救GIOP：在成功建立GIOP模型的基础上，用从中药淫羊藿（FE）中提取的黄酮类化合物治疗该模型，其在大鼠研究中起到抗op作用，从而检验该模型的临床相关性。对1μg/ml FE对斑马鱼骨生长影响的初步分析表明，FE刺激可以增加骨质量，这在荧光区和IOD中都有反映。为了研究FE对GIOP模型的修复作用，将不同浓度的FE与10μM的DEX混合，对4～8dpf的斑马鱼幼虫进行了试验。结果，添加1μg/ml FE的混合物将斑马鱼幼虫从大脑和躯干连接区域的弯曲身体被挽救。TG（ola.sp7:nlsGFP）图像的形态学分析表明，与GIOP组相比，1μg/ml FE处理幼虫的荧光面积和IOD再次升高。这表明，1μg/mlFE处理能显著抑制骨丢失。这些结果与传统茜素红染色组的图像分析一致。上述结果表明，FE能预防骨缺损，提示FE对OP有潜在的治疗作用。

 

成骨细胞转录因子Osterix、骨钙素、骨桥蛋白以及调节骨和基质形成的破骨细胞因子Tracp被报道参与了OP。因此，qrt-PCR用于分析GIOP斑马鱼中同源成骨细胞和破骨细胞相关基因的表达水平。与DMSO治疗的对照组相比，DEX治疗下调了骨桥蛋白、骨钙素和骨桥蛋白的表达水平，而TRACP表达显著上调。与GIOP组相比，FE治疗上调了Osterix、骨钙素和骨桥蛋白的表达,但对TRACP的表达没有影响。此外，与成骨细胞中的eGFP蛋白表达变化一致，在GIOP模型中，eGFP mRNA的表达水平也下调。

 

讨论：我们的GIOP模型的一个局限性是，由于eGFP只标记成骨细胞，所以它不能在形成OP样症状时标记破骨细胞。因此，该模型只能用于筛选对成骨细胞有直接作用的抗OP药物。它不适合研究破骨细胞参与的组织病理学。然而，与传统的茜素红染色方法相比，使用TG（ola.sp7:nlsGFP）斑马鱼可以很容易地通过eGFP信号来评估骨质量和密度。它不仅消除了染色和漂白的繁琐过程，而且避免了化学染色引起的不稳定信号。因此，该模型及相关评价方法可用于抗OP药物的筛选。