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成年狨猴肾脏细胞体外培养体系的建立及CRISPR/Cas9基因编辑的应用

2019年09月09日 浏览量: 评论(0) 来源:中国比较医学杂志2019年第8期 作者:丛日旭 佟巍 向志光 张丽芳 刘先菊 阮研硕 郭智 刘云波 责任编辑:admin
摘要:建立成年狨猴肾脏细胞体外培养的培养体系,并将Cas9编辑系统初步应用于所培养的狨猴肾脏细胞,建立检测sgRNA切割活性的体系。

目的:建立成年狨猴肾脏细胞体外培养的培养体系,并将Cas9编辑系统初步应用于所培养的狨猴肾脏细胞,建立检测sgRNA切割活性的体系。

方法:取成年的狨猴肾脏,采用贴壁法、消化法得到狨猴肾脏细胞。对细胞进行生长曲线测定、转染试剂(Viafect和Lipo2000)及抗性(嘌呤霉素和杀稻瘟菌素)浓度筛选,将SIRT1的sgRNA质粒和Cas9质粒共转染狨猴细胞,提取基因组并对基因修饰目的片段扩增,并将扩增产物进行测序。

结果:建立狨猴肾脏细胞体外培养体系;ViaFect转染试剂转染率大于60%;细胞抗性筛选适宜浓度嘌呤霉素4μg/mL,杀 稻瘟菌素8μg/mL;测序结果表明,从sgRNA的PAM序列附近开始出现突变峰,证明sgRNA成功引入突变。

结论: 成功建立了狨猴肾脏细胞的体外培养、细胞转染和抗性筛选体系;CRISPR/Cas9可以用于狨猴肾脏细胞编辑,为 基因修饰狨猴靶点选择提供依据。

全文阅读:成年狨猴肾脏细胞体外培养体系的建立及CRISPR/Cas9基因编辑的应用

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