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斑点鼠干货第四弹：Nature Communications重磅！“超级明星”HIF1α居然在类风湿性关节炎中扮演大反派？

2019年10月14日来源：集萃药康作者：集萃药康责任编辑：admin

摘要：斑点鼠干货第四弹：Nature Communications重磅！“超级明星”HIF1α居然在类风湿性关节炎中扮演大反派？

类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis, RA）是一种常见的慢性自身免疫病，患者会出现关节疼痛、僵硬、畸形，更严重者甚至出现呼吸系统、神经系统或心血管系统的损伤。

Cynthia S. Crowson，这位RA界泰斗级的女科学家，在她最新发表的流行病学调查中指出，RA的全球发病率约为0.5-1%，并且女性发病概率约是男性的两倍¹。RA的风险因素包括遗传、年龄、饮食、环境、感染和性激素等，具体致病原因尚不明确²。无论如何，造成关节损伤的机制无一例外都涉及到免疫细胞和炎症因子在局灶的累积，进而促进由破骨细胞介导的骨侵蚀（Bone erosion）³。

图1. RA病人的关节特写

图片来源：rudisill/Getty Images

传统的抗风湿药（DMARDs）包括甲氨蝶呤（Methotrexat），柳氮磺吡（Sulfasalazine），来氟米特（Leflunomide，LEF）和羟基氯喹（Hydroxychloroquine）四种，它们是抗RA的一线药物。

欧洲抗风湿病联盟（EULAR）明确指出：在被确诊为RA后首选的治疗方案应该是甲氨蝶呤配合小剂量糖皮质激素；如果病人对甲氨蝶呤不良反应明显，如出现肝损伤或肾损伤，可用柳氮磺吡啶或LEF代替。生物类DMARDs是二线抗RA药物，主要包括阿达木单抗、依那西普等TNF拮抗剂。若单用一、二线DMARDs均无效，则应尝试药物联用方案，必要时考虑中量糖皮质激素疗法，但副作用过大。最后，还有一部分被称之为“难治性RA”的病人对以上所有药物均不敏感，且尚无有效的疗法。

图2. HIF1α抑制剂Acriflavine和LEF联用是治疗RA的全新精准医疗策略

对这部分难治性RA病人，科学家们并没有放弃。来自香港浸会大学吕爱平(Aiping Lu)、张戈（Ge Zhang）团队与香港中文大学中药学院张保亭（Bao-Ting Zhang）团队合作发现：LEF与Acriflavine联用可作为治愈RA的全新精准医疗策略⁴。这一研究发现发布在10月8日的《自然通讯》（Nature Communications）杂志上（图2）。

他们的研究中所使用的药物，是传统DMARDs LEF（原名Arava）——由赛诺菲安万特（Sanofi Aventis）公司研发，并于1998年被美国食品与药物管理局（FDA）批准使用的免疫抑制药物。机制是其在肝脏内的代谢产物A77 1726可以抑制免疫细胞中线粒体二氢乳清酸脱氢酶（DHODH）的酶活，从而减少免疫细胞的增殖，最终降低局灶炎症反应⁵。但是美国风湿病学院（ACR）曾经指出，只有40-50%的RA患者服用了LEF后病情有轻微的改善（临床评分下降在20%以内）⁶。

介绍完以上背景后，两个问题值得我们深思：

1.既然多半RA患者对LEF不敏感，吕教授团队为什么还要重点研究LEF？

2.服用LEF有效与无效的RA患者之间区别点在哪？

答案将被一一揭晓——

图3. CPR^Higher的PBE+ RA病人或CIA模型大鼠用LEF治疗的预后较差

首先，他们将RA病人按病情分成已经发生骨侵蚀（PBE-positive, PBE+）和尚未发生骨侵蚀（PBE-negative, PBE−）两组共计250位病人，全部接受Leflunomide治疗12个月后发现只有PBE−组（130位）病人病情得到缓解（图3A，B）。紧接着他们对比了剩下120位PBE+组病人的血清学指标基线，发现了有趣的现象：PBE+组病人血清中C反应蛋白（CRP）水平比PBE−组更高，血清抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP5b，骨侵蚀指标）的释放也更多（图3C，D）。在胶原蛋白诱导关节炎(CIA) 的大鼠模型中他们也得出类似的结果（图3E）。

也就是说，已经发生了骨侵蚀且CRP^Higher的病人有超过92%的概率对LEF的治疗是无效的。这无疑是对CRP^Higher的病人是一个雪上加霜的坏消息。结合已有的研究结论“CRP参与了破骨细胞生成”，我们可以大胆的推测：CRP是造成RA病人骨侵蚀的不法分子，CRP^Higher更是直接导致了LEF的失效。

图4. CRP抑制剂或肝脏靶向siRNA敲降CRP均可缓解CIA模型大鼠骨侵蚀表型

为了证实这一推断，在CIA诱导的RA大鼠模型中，吕教授团队在大鼠的关节内注射CRP特异性抗体（图4A，C），或将siRNA通过尾静脉输送至CRP产生的源头——肝脏抑制其表达（图4B，D），用这两种方法阻断CRP的功能后，RA模型大鼠的骨侵蚀程度均得到不同程度的缓解。以上结果证实了CRP的确是造成RA病人骨侵蚀的罪魁祸首。

在确认CRP的作用后，我们还需揪出两个人物：一，CRP幕后boss；二，CRP下游帮手。

图5. LEF可以直接与AHR结合，进而促进LEF-AHR-ARNT信号通路的激活并降低CRP释放，部分缓解骨侵蚀

首先，CRP背后受何人指使？有报道称，CRP的表达受芳香烃受体（AHR）信号通路的负调控。这里简单介绍一下，AHR需要配体的激活才能发挥作用，其配体一般需要同时满足芳香化合物结构特征和疏水性两个条件。在配体的刺激下，AHR转移到细胞核中并与ARNT（芳香烃受体核转运体）结合后调控下游基因转录⁷。他们惊喜地发现：作为DMARDs一份子的LEF本身（而非其代谢产物A77 1726），竟然也可以作为AHR的激动剂（图5A）。真是无巧不成书，我们的问题1在这里找到了答案。

在体外实验中，LEF的存在可以促进AHR与ARNT的结合，进而下调CRP的表达水平（图5B，C）。活体实验也证实，LEF对CIA诱导的CRP^Lower大鼠模型的骨侵蚀的缓解程度明显优于其代谢产物A77 1726。不过遗憾的是，作者在这里指出，无论是LEF还是A77 1726对CIA诱导后的CRP^Higher大鼠均无治疗效果，提示在发病早期及时抑制CRP的释放是预防和治疗RA的关键节点，患者CRP水平升高后再介入治疗的效果就会大打折扣。我们的问题2在这里也找到了答案。

那么，是不是意味着已经发生骨侵蚀的CRP^Higher RA病人可以被迫放弃治疗了呢？

当然不是！下面要出场的，是本周全球最受瞩目的蛋白——HIF1α（不过这次它扮演的是反派~_~）。

图6. CRP通过诱导HIF1α表达抑制LEF-AHR-CRP通路的激活

在调查CRP下游靶点的时候，该团队发现：CRP能上调HIF1α的表达（图6A，B）。之前有学者指出，HIF1α的功能之一是与AHR竞争性结合于ARNT，从而干涉LEF-AHR-CRP信号通路的激活。于是，他们尝试在肝脏特异性敲除HIF1α基因（HIF1α-HKO）后再用LEF治疗CIA诱导的RA模型，发现大鼠的骨侵蚀程度得到极大的缓解（图6C-E）。作为CRP的帮凶，FDA批准药物Acriflavine（ACF）就是HIF1α的特异性抑制剂，用ACF处理CIA诱导的RA模型可以起到与HIF1α-HKO类似的治疗效果。

图7. LEF和ACF联用显著改善CRP^Higher CIA大鼠的骨侵蚀

最后，本研究揭示了CRP-HIF1α通路是造成CRP^Higher RA病人对LEF治疗不敏感的主要原因。在此基础上，该研究团队推出了RA的全新精准医疗策略：HIF1α抑制剂ACF与LEF联用可更有效的治愈RA（图7）。

我们对三位老师团队的成果表示祝贺和感谢，并期待未来此疗法的临床反馈。

众所周知，HIF1α蛋白必须在缺氧的环境中才能积累，在氧充足的环境中会被快速的泛素化降解。关节腔内血管较少，氧输送缓慢，使得关节处多种类型的细胞如软骨细胞、韧带成纤维细胞时刻处在1-10%的低氧分压环境中，它们已进化出一套完善的应对低氧微环境的能力。局灶低氧是否对RA的预后造成影响是本研究给临床治疗提供的新治疗思路。

实际上，除了CRP-HIF1α通路外，还有很多不同类型的免疫细胞和炎症因子相互交错成阶层式调控网络，在RA发病过程中扮演不同的角色。在药物研发领域中，已有不少炎症因子及其受体作为潜在的治疗靶点被开发，有些靶点已经在临床取得不俗的成绩（表1）。

表1.部分炎症因子及其受体靶向药物的临床研究进展

（数据来源：医药魔方数据库，集萃药康整理，滑动查看）

但由于调控网络的复杂性，仍有很多信号通路在RA中的作用尚不明确。此时，集萃药康斑点鼠计划中构建的各个基因的基因敲除小鼠（KO,CKO）就派上用场啦。随心所欲，哪里有趣敲哪里。目前，斑点鼠计划已成功建立5000余品系，涵盖了肿瘤、代谢、免疫、骨发育等热门研究方向的基因。目前与RA相关所有信号通路（图8）所涉及的基因，现斑点鼠产品的覆盖率就超过60%（表2）。

图8. RA信号通路（图片来源：KEGG）

表2.集萃药康RA信号通路相关基因敲除小鼠模型资源

精彩继续！除了助力科研、聚焦基因功能及调控，开发新的潜在治疗靶点外，我们同样重视药效及毒性评价，并为此构建了一系列RA相关的人源化小鼠（表3）。

表3.集萃药康人源化RA小鼠模型资源

参考文献：

1.Myasoedova, E., Davis, J. M., 3rd, Achenbach, S. J., Matteson, E. L. & Crowson, C. S. Trends in Prevalence of Functional Disability in Rheumatoid Arthritis Compared With the General Population. Mayo Clinic proceedings 94, 1035-1039, doi:10.1016/j.mayocp.2019.01.002 (2019).

2.Calabresi, E., Petrelli, F., Bonifacio, A. F., Puxeddu, I. & Alunno, A. One year in review 2018: pathogenesis of rheumatoid arthritis. Clinical and experimental rheumatology 36, 175-184 (2018).

3.Catrina, A. I., Svensson, C. I., Malmstrom, V., Schett, G. & Klareskog, L. Mechanisms leading from systemic autoimmunity to joint-specific disease in rheumatoid arthritis. Nature reviews. Rheumatology 13, 79-86, doi:10.1038/nrrheum.2016.200 (2017).

4.Liang, C. et al. HIF1alpha inhibition facilitates Leflunomide-AHR-CRP signaling to attenuate bone erosion in CRP-aberrant rheumatoid arthritis. Nature communications 10, 4579, doi:10.1038/s41467-019-12163-z (2019).

5.Fox, R. I. et al. Mechanism of action for leflunomide in rheumatoid arthritis. Clinical immunology (Orlando, Fla.) 93, 198-208, doi:10.1006/clim.1999.4777 (1999).

6.Strand, V. et al. Treatment of active rheumatoid arthritis with leflunomide compared with placebo and methotrexate. Leflunomide Rheumatoid Arthritis Investigators Group. Archives of internal medicine 159, 2542-2550, doi:10.1001/archinte.159.21.2542 (1999).

7.Patel, R. D., Murray, I. A., Flaveny, C. A., Kusnadi, A. & Perdew, G. H. Ah receptor represses acute-phase response gene expression without binding to its cognate response element. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology 89, 695-707, doi:10.1038/labinvest.2009.24 (2009).

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撰稿：王鼎玉、张佩珊

编辑：钱利圣

审核：王宏宇