微卫星DNA在动物遗传育种中的应用
1.个体及亲缘关系鉴定 由于微卫星DNA具有高度的个体专一性和多态性,已逐步代替了人们最早使用的血型、血液蛋白等多态性低的指标,在血缘关系鉴定方面起着重要的作用。微卫星DNA在个体及血缘关系鉴定中应用最早的是微卫星指纹技术(Ali等,1986)。微卫星在真核生物基因组中为数众多且均匀分布,不仅大量分布于基因的间隔区、内含子中,而且还分布于基因的外显子和调控区(如启动子、增强子)中。因而微卫星指纹图具有高度的个体代表性,能充分反映基因组的特征。而且微卫星探针不用从基因组中克隆得到,种类丰富,仅二核苷酸重复类型就有6种,且均可人工合成。
众多研究表明,无论家畜还是家禽中,其DNA指纹图都具有程度不等的个体特异性,两个个体具有相同的DNA指纹图的概率仅为万分之一。在相同的杂交条件下,多数探针在家禽上产生DNA指纹图的图带数大于大多数在家畜上产生的图带数。因此,一般来说家禽DNA指纹图具有更高的个体特异性。鉴于畜禽DNA指纹图高度的个体特异性,它们可以有效地用于个体识别。例如,Plante等(1992)成功地利用DNA指纹图鉴别了数十例双生牛犊的卵性(同卵双生或异卵双生);Gatei等(1991)用DNA指纹图鉴别了双胞胎和三胞胎羊的卵性。
由此可见,DNA指纹分析是鉴别异卵或同卵双生的有利工具,同时也是现代畜牧生产中人工授精和胚胎移植的可靠鉴定手段。同时,DNA指纹图还可以用于畜禽繁育中血统登记及父权认定。
2.分析群体的遗传结构及群体间遗传距离 畜禽品种资源的保存和开发利用是畜牧生产中的主要问题,而合理的保种及开发利用有赖于对现有品种群体遗传结构及遗传关系的深入了解。因而直接研究遗传物质DNA的变异性具有重要意义。由于微卫星在真核生物基因组中的广泛随机分布,可以很好地代表基因组的特征,不仅可以反映不同个体之间的遗传相似程度,还可以反映群体之间的遗传相似程度,并可根据多个微卫星位点在不同群体中出现的等位基因频率计算杂合度、遗传距离等来预测品种(系)间的杂种优势。因而,微卫星多念性分析在畜禽遗传多样性评估、品种资源的分类、保存和利用方面发挥着重要作用。
Kuhmlein等(1990)对7个已知近交系数(0.026~0.98)的鸡品种(系)进行的DNA指纹图分析表明,品种(系)内的DNA指纹图相似系数随着近交系数的上升而增加;在近交系数大于0.98的两个品系内,个体DNA指纹图基本一致,平均相似系数也达到了最高。Barker等(1997)采用21个微卫星位点分析了1个亚洲水牛群体内及群体间的遗传变异,并与5个蛋白多态位点相比较,由微卫星得到的系统分化树与这些牛群的地理分布相同,而由蛋白位点得到的系统分化树却与之相异。Peelman等(1998)利用23个微卫星位点分析了4个牛品种的杂合度、多态信息含量和遗传距离,认为用微卫星位点估计品种间或品种内的遗传变异是非常有效的。孙少华(1999)利用6个微卫星位点分析了8个肉牛杂交亲本群体的遗传结构,认为根据微卫星DNA多态性计算的亲本遗传距离绘制的系统聚类图能清晰、客观地反映出这8个肉牛群体的地理分布、遗传分化特点和它们之间的亲缘关系,为预测杂交效果提供依据。
3.监测育种和遗传操作效应 在畜禽育种中,常常通过多代回交将某一品种(供体)某个性状基因渗入到另一品种(受体)的基因组中,但不希望将供体的其他基因整合到受体品种中。由于微卫星 DNA能较好地代表基因组,那么就可用其监测回交过程中供体品种基因组渗入各回交后代个体的程度,然后从中选择那些携带了供体的目标渗入基因而微卫星多态性与受体最相似的个体,由此可以大大减少回交世代数。Hillel(1990)等首次报道了用DNA指纹分析法监测品种选育过程中基因渗入的程度。他们以北山羊和山羊杂交育成杂种羊为研究材料,以DNA指纹图共有带率衡量在回交过程中杂种羊的基因组遗传变化,提出了基因组选择(Genomic selection)的概念。
在转基因试验中,DNA指纹图可用于检测体细胞嵌合体及供体细胞种质的遗传性。Petitte等(1990)将横斑洛克鸡的胚盘细胞注射到矮种自来航鸡的卵细胞中,产生的嵌合体公鸡的DNA指纹图含有很多来源于洛克鸡的图带,嵌合体与受体杂合的后代鸡也携带有来源于洛克鸡的图带,从而证明来自于供体细胞的种质是可以遗传的。同样原理,DNA指纹图还可以用来监测外界因子对动物细胞系基因组的影响程度,也可用来鉴别胚胎移植产生出后代的真实血缘。
4.构建基因图谱 构建基因图谱是研究生物基因组结构、性状控制的分子基础和基本方法,通过基因图谱可以详细了解控制那些有价值的数量性状或抗病性状的位点的组成和表达调控机制,以便于操作这些基因。此外,还可以根据已建立的基因图谱,通过反求遗传学方法,分离、克隆控制目的性状的基因。在研究比较不同物种的基因组成和进化方面,基因图谱也有很大作用。完整的基因图谱包括连锁图谱与物理图谱。通过对多个基因之间的连锁关系分析可以发现,多个基因中有一些基因是连锁在一起的,并与其他基因独立,从而形成一个连锁群,而另外的其他基因也分别形成了不同的连锁群。一个生物体的连锁群数目应该与其染色体数目相等。根据基因之间的距离,将这些基因之间的相对关系反映为图的形式即为遗传连锁图。物理图谱是通过细胞生物学的手段,将多个基因直接定位在染色体上。
长期以来,遗传学家一直在为构建遗传连锁图谱寻找适宜的遗传标记,表型标记、细胞生物学标记以及生化标记都被先后利用过,但由于上述标记存在多态性不足、数量有限等缺点,大大限制了遗传图谱制作的过程。近年来不断发展的分子遗传学为构建遗传连锁图谱提供了理想的遗传标记,最先被利用的是限制性酶切片段长度多态性(RFLP),然后是小卫星和微卫星。由于微卫星DNA具备丰富的多态性,在染色体上的分布更广泛并在各个生物体中都普遍存在等优点,成为目前遗传连锁图谱制作的主要标记。近年来利用微卫星构建遗传图谱日趋增多,已逐步取代了RFLP法。美国农业部构建了牛遗传图谱框架(平均标记间隔8.9cm),其中含有313个标记,244个是微卫星标记(Bishop等,1994)。Illinois大学构建出公牛IRRF(Illinois reference resofrce family)图谱,平均标记间隔9.73cm,其中含269个标记,249个是微卫星标记(Ma等,1996)。
5.寻找与生产性状位点连锁的分子遗传标记 畜禽育种工作者长期以来主要根据个体或群体的表型值对一些重要的经济性状(如产量、繁殖、生活力)进行选择和改良,原因在于无法确定个体的基因型。然而这类性状的表型值大多是多个基因与环境相互作用的综合表现。根据表型值的选择易造成较大的误差,更无从研究单个基因的效应及其调控机制。另一方面,这类性状要在个体生长发育到一定的时期才能表现出来供选择,因此育种周期长、费用高。
利用DNA分子遗传标记跟踪基因组中各染色体区段的遗传分离规律,结合性状表现型的遗传规律,可以确定与某些性状连锁遗传的染色体区段或DNA标记。一旦找到重要性状的标记,那么在个体发育的早期就可进行选种,从而避免传统选种法的弊病。据估计,大多数家畜的染色体长度为20~30cm,如果有100个在染色体上随机分布的遗传标记,则某个性状基因与其中的至少一个遗传标记相连锁(二者之间的距离小于或等于0.2cm)的概率达70%以上。由于微卫星DNA在染色体上随机分布而具有高度多态性,所以以微卫星DNA作为分子遗传标记是可行的。Georges等(1990)用5个DNA指纹探针对比利时blue牛的家系分析后发现,探针ETD产生DNA指纹图中的一条带与牛的肌肉肥大基因紧密连锁。Ron等(1994)发现,微卫星位点D21S4与控制产奶量的乳蛋白产量QTL定位于牛的3号染色体上。Ashwell等(1997)在7个美国荷斯坦牛半同胞家系中,应用16个微卫星标记检测体细胞数、乳脂量、乳脂率、乳蛋白率及乳蛋白量QTL,发现其中3个标记(BM703、BM4505 and BM2078)对不同性状有显著影响。