摘要：血管内皮生长因子（VEGF）在肿瘤血管生成中起着关键作用，靶向VEGF的治疗在肿瘤治疗中被广泛应用。我们开发了一种针对人VEGF165的治疗性疫苗。hVEGF26-104/RFASE是以截断蛋白hVEGF26-104为抗原，在含有硫酸多糖RFASE作为佐剂的水包油乳剂中制备。我们描述了这种治疗性疫苗在食蟹猴中的毒性和免疫原性。

 

方法：54只食蟹猴被分为7组。第1-3组为对照组，单用PBS（第1组）、单用RFASE（第2组）或单用hVEGF26-104（第3组）。4-7组的动物接受hVEGF26-104和RFASE，但使用不同剂量的抗原或佐剂。所有动物每隔2周接种一次共接种4次，直到最后一次接种后3天监测安全性和免疫原性。

 

结果：RFASE佐剂免疫诱导了依赖性急性期反应。首次免疫后28天，在猴血清中发现了高滴度的抗hVEGF26-104抗体，并与hVEGF165交叉反应。在竞争ELISA中，这些抗体能够抑制单克隆抗体bevacizumab与hVEGF165的结合。此外，在VEGF特异性生物测定中加入免疫猴血清可抑制hVEGF165的生物活性。重要的是，在整个研究过程中没有观察到常见的VEGF中和不良反应。

 

结论：这些数据表明hVEGF26-104/RFASE可以安全地应用于食蟹猴，诱导所需的免疫应答，从而支持该疫苗的临床开发。

 

 

简介：用单克隆抗体贝伐单抗或融合蛋白aflibercept靶向血管内皮生长因子（VEGF）可延长晚期癌症患者联合化疗的生存期。在血管内皮生长因子抑制治疗的疾病进展之后，肿瘤生长仍部分依赖于VEGF。提示抗VEGF治疗耐药机制的差异。然而，使用这些药物所取得的临床效益仍然相当有限，强调需要找到方法来增强以血管内皮生长因子为靶点的药物的治疗效果，特别是因为有人认为需要长期VEGF抑制才能最大限度地发挥治疗效益。主动免疫靶向血管内皮生长因子具有持续稳定抑制血管内皮生长因子的优点。这意味着，在提高成本效益的同时，患者的治疗负担会减轻。通过主动免疫抑制血管内皮生长因子提供更有效的中和作用因为血管内皮生长因子蛋白的多个表位是靶向的，而不是贝伐单抗的一个表位。我们小组和其他人已经研究了VEGF疫苗的潜力。在对晚期实体瘤患者进行的第一次人类I期临床试验中，发现疫苗是安全的，并且在30名患者中的24名患者中观察到了对血管内皮生长因子的持久免疫反应。hVEGF26-104/RFASE是一种治疗性抗血管生成疫苗，旨在诱导人VEGF165的交叉反应性多克隆抗体应答。通过氨基酸序列的微小改变和hVEGF蛋白的截断，打破免疫耐受。其体内的VEGF中和和抑瘤能力已被我们所证实。在人的同源模型（食蟹猴）中，研究了hVEGF26-104与RFASE佐剂联合应用的安全性和免疫原性。我们证明重复免疫是安全和耐受性良好的。此外，还可以诱导有效的中和抗VEGF抗体反应。

 

动物：本研究选用54只雄性和雌性食蟹猴（各27只）。在给药开始时，猴子的年龄大约2至5岁，体重雄性2.7至4.6公斤，雌性2.9至3.5公斤。

 

疫苗：除了内源性蛋白质（hVEGF165）被截断为79个氨基酸（26-104）外，残基51和60上的2个半胱氨酸被丙氨酸取代，以防止蛋白质二聚和随后的受体结合。肽经高效液相色谱纯化，并根据前面描述的折叠条件正确折叠形成VEGF的cys结结构。RFASE-佐剂是含有聚山梨酯80和RFASE的磷酸角鲨烷磷酸盐缓冲盐水（PBS）的亚微米乳剂。RFASE佐剂被设计用作抗原库，具有免疫刺激作用，并使免疫反应偏向体液免疫。在给药前，将1 mL hVEGF26-104与1 mL RFASE佐剂混合。

 

研究设计：根据图1a将动物分为7组。根据先前啮齿动物研究的推断和计划临床试验中使用的预期剂量，选择不同剂量的抗原和佐剂。每隔2周动物免疫一次共免疫4次。 通过左右大腿各两次肌内注射免疫猴。 第四次免疫后三天（第46天），对动物实施安乐死以测定器官毒性。在恢复研究中包括了12只动物（第1、6和7组各4只动物），以评估该疫苗在第四次免疫后另外4周的毒性和免疫原性的可逆性。对所有研究动物进行完整的尸检。 动物用氯胺酮镇静，并用戊巴比妥钠麻醉。

 

生理及生化检查：这些动物每天检查两次，看是否有发病或死亡的迹象。 使用Draize评分系统在每次注射前以及每次注射后24和48小时对局部注射部位反应进行评分。在每次注射之前以及注射后3、24、48和96小时时记录所有动物的体温。在第29天服药后约168小时，记录体温，以确认体温在较长时间内恢复到基线水平。每周记录每只动物的体重。在hVEGF26-104/RFASE之前和给药结束时测量一次血压。从所有动物的头静脉或隐静脉采集血液。动物在采集血液和尿液前禁食一晚。在第一次免疫后24小时和42天，对所有动物的外周血进行血液学、临床化学和凝血参数检查。在恢复研究的第70天重复这些测量。

 

ELISA:根据制造商的说明，在第46天使用市售酶联免疫吸附试验（ELISA）测定主要研究中所有动物的血清hVEGF浓度。Ba / F3-VEGFR2生物测定：用VEGFr2的胞外结构域和小鼠促红细胞生成素受体（mepor）的跨膜和胞浆结构域组成的受体嵌合物转染亲代Ba/F3细胞，形成了一个依赖人VEGF或小鼠il-3的细胞系。用Ba/F3-VEGFr2细胞增殖试验评估疫苗诱导抗体的中和能力，其中动物血清（研究第46天采集的血清的10%）与hVEGF 1.25 ng/ml和Ba/F3-VEGFr2细胞共孵育。有关生物测定的详细程序见补充材料和方法。用市售灵长类IFNγELISPOT评估HVEGF26-104/RFASE诱导VEGF特异性细胞毒性T细胞（CTL）应答的能力。采用密度梯度离心法从EDTA血中分离出外周血单个核细胞（PBMC），并在冷冻培养基（87.5%FCS/12.5%DMSO）中冷冻保存。将食蟹猴外周血单个核细胞（PBMC）与自体猴PMBC（用hVEGF165肽脉冲）孵育10 d，然后用肽再次激发，并进行IFNγELISPOT检测。

 

结果：注射部位反应和体温：单用RFASE佐剂或与hVEGF26-104联合应用时，主要表现为水肿和肌肉肿胀。在加强免疫后，水肿的发生率和严重程度以及肌肉肿胀的发生率增加。在单独接受RFASE佐剂（第2组）或与hVEGF26-104联合使用（第4、5、6和7组）的动物中，在所有免疫接种后观察到体温轻度上升。48小时后，所有组的体温均恢复到基线水平。 免疫后24小时的体温升高在第5、6和7组之间没有显著差异，但是与第6组相比，第4组的体温升高明显更大。

 

生理和生化观察：hVEGF26-104/RFASE免疫与高血压的发生无关。与对照组相比，4-7组的发病率和月经周期没有受到影响，表明hVEGF26-104/RFASE对生理血管生成没有不利影响。与基线相比，在接受RFASE佐剂或与hVEGF26- 104（第2、4、5、6和7组）联合使用的动物中，与基线相比，第2天白细胞（WBC）计数（p <0.05）和C反应蛋白（CRP）（p <0.05）显着增加。白细胞计数的增加主要是由于中性粒细胞增多（绝对计数和百分数），而淋巴细胞减少（计数和百分数）。在这些组中，与组1相比，活化的部分凝血活酶时间（APTT）和纤维蛋白原在第2天也有所增加。 血液，化学和凝血参数的所有显着变化均在第42天恢复到基线水平。在恢复的动物组中也未观察到进一步的变化。

 

病理：肌肉注射部位的显微镜检查结果包括微小至中度间质纤维增生和泡沫巨噬细胞浸润，以及微小至轻度嗜酸性粒细胞和单核细胞浸润。在所有组中都记录了这些发现，但是在第3组中，这些发现的发生率要低得多（仅适用于hVEGF26-104）。此外，虽然其他组之间的显微镜检查结果的发生率没有明显差异，但与其他组相比，第1组（安慰剂组）的显微镜检查结果的严重程度似乎更低。最后，单核细胞浸润的发现似乎与抗体的诱导有关，因为在那些接受hVEGF26-104和RFASE佐剂的组中，这些浸润的发生率和严重程度更高（4、5、6和7组）。在恢复组，这些显微镜检查的发生率和严重程度在第70天降低。所有的动物都活了下来，按计划进行尸检。尸检显示，在第46天（主要研究）或第70天（恢复研究）没有RFASE或hVEG26-104疫苗相关器官重量的变化。第6组有1只生精小管中度变性。因为这种变化只发生在一只动物身上，所以还不确定这些变化是否与hVEGF26-104/RFASE有关。在不同实验组动物的其他器官中没有发现其他相关的显微镜发现。

 

抗血管内皮生长因子抗体反应：除第4组中的一只动物外，在所有接受hVEGF26-104和RFASE佐剂的组中均检测到了抗hVEGF165抗体应答的诱导（第4、5、6和7组）。在第3组（仅限hVEGF26-104）的任何血清中均未检测到抗hVEGF165抗体，显示需要将hVEGF26-104与RFASE佐剂一起施用以诱导抗hVEGF165抗体。首次免疫后6～8周，抗hVEGF165抗体滴度达到高峰。最高抗体滴度在1.5到4.3之间变化（血清稀释度为1:31到1:19953）。第4、5、6和7组的所有血清均采用竞争ELISA法检测，以评估这些血清是否能与贝伐单抗竞争与hVEGF165的结合。hVEGF26-104 / RFASE免疫诱导的抗血清能够抑制hVEGF165与贝伐单抗的结合，表明免疫诱导的抗体反应包括针对与贝伐单抗相同的hVEGF165表位的抗体。此外，抗VEGF抗体滴度与贝伐单抗hVEGF165结合抑制率呈正相关。

 

Ba/F3-VEGFr2生物测定中的VEGF中和作用：在依赖VEGF的生物测定中（使用Ba / F3-VEGFR2细胞），研究了第1、4、5、6和7组所有血清的VEGF中和能力。来自第4、5、6和7组的抗血清在Ba / F3-VEGFR2生物测定中显着抑制VEGF驱动的细胞增殖，，尽管这种作用与竞争性ELISA中的抗VEGF抗体滴度或贝伐单抗-hVEGF165结合的抑制无关。

 

VEGF-ELISA法：在第46天测定所有动物的血清hVEGF水平。hVEGF26-104/RFASE免疫的动物血清hVEGF165浓度与第一组相比没有变化。与对照组1相比，第3组（仅接种hVEGF26-104的动物）的血清hVEGF浓度显著降低。

 

IFNγELISPOT测定t细胞反应：为了确定用hVEGF26-104 / RFASE免疫是否还会诱导针对hVEGF的1型T细胞应答，在第46天对从12组，1、2、3和6组中随机选择的12只动物分离的PBMC进行了IFNγELISPOT分析。根据我们对阳性反应性的定义（参见补充材料和方法），由于对照样品（仅DMSO）的背景值很高，因此没有一个样品对hVEGF表现出明显的阳性反应性。然而，该结果似乎确实表明，用hVEGF26-104 / RFASE佐剂（第6组）免疫可诱导低水平的VEGF肽特异性1 T细胞应答，而在任何对照组（1、2和3）中均未观察到特异性的VEGF特异性-1 T细胞应答。

 

结论：数据表明，可以以临床相关剂量安全地在食蟹猴中施用hVEGF26-104 / RFASE，并且可以中和能力诱导高滴度的多克隆抗hVEGF抗体。 人类一期临床试验已经开始研究晚期实体瘤患者的安全性和免疫原性。