简介：背景：活性氧（ROS）是由许多细胞过程产物，在许多细胞过程中是必不可少的。然而，ROS是高度反应性的，如果未被内源性抗氧化剂系统中和，可能导致广泛的细胞损伤和/或发病机制。此外，暴露于广泛的环境压力也可导致过剩的ROS产生，从而导致氧化应激（OS）和下游组织毒性。目的：我们的目标是生产一个稳定的转基因斑马鱼系，不受组织特异性基因调控的限制，在暴露于各种OS诱导的环境污染物和条件下，它能够提供组织特异性OS的全组织、实时读出。因此，对于导致OS的所有环境条件，该模型都可以用作敏感而特异的体内生物标记物。为了实现这一目标，我们开发了作为细胞对OS反应起关键作用的全局性主调节器的亲电响应元件（EpRE）。为了测试组织特异性和定量能力，我们选择了一系列已知能在特定器官或组织中诱导OS的化学污染物，并使用mCherry荧光强度的微观测量来评估每种污染物的剂量反应性。结果：我们制备了第一个稳定的转基因斑马鱼系Tg（3EpRE:hsp70:mCherry），在体内近实时检测细胞氧化还原失衡。我们应用这个新的模型来量化暴露于一系列高分辨率环境条件下的OS，并提供了化合物和组织特异性ROS诱导的毒性的定量。讨论：我们的模型具有非常广泛的潜在应用范围，不仅用于水环境中的毒物的生物监测，而且在生物医学中用于识别涉及许多重要的人类疾病，包括癌症的进展中的ROS介导的机制。

 

 

简介：活性氧（ROS）可由所有需氧生物中的许多代谢过程产生，在细胞信号、免疫和凋亡等方面具有重要的生理作用。然而，ROS具有高度的反应性和非中性，可以诱导细胞内脂质、蛋白质、RNA和DNA的损伤。因此，细胞内氧化还原稳态通过复杂的ROS产生平衡和内源性抗氧化剂系统的中和来维持。暴露于任何应激源可能导致多余的活性氧产生导致细胞氧化还原状态在被称为氧化应激（OS）的过程中发生变化。在外源性化学毒物进入细胞的情况下，自由基的产生可能是由于细胞色素P450系统或线粒体通过I期代谢引起。重要的是，持续的氧化应激会导致慢性炎症，与许多人类疾病相关，包括癌症、糖尿病、痴呆和心血管疾病。此外，炎症通路刺激自由基的产生，从而形成氧化应激的反馈回路。维持氧化还原稳态的关键细胞机制是Nrf2转录因子（Nrf2-Keap1调节系统）。该途径通过作用于亲电反应元件（EpRE）（也称为抗氧化反应元件（ARE））来监督数百种细胞保护性基因的调控，进而介导II期解毒酶的诱导和对氧化应激的代谢反应。尽管具有保护作用，但Nrf2途径的过度激活将通过保护细胞免受氧化应激和化学治疗剂的作用，减少凋亡并为正常细胞和恶性肿瘤创造有利条件。因此，这种调节系统在许多人类癌症的进展和持续中起着关键作用。Nrf2-Keap1系统在脊椎动物中高度保守，组织限制性诱导似乎是Nrf2靶基因跨物种的一个内在特征。例如，微阵列分析显示Nrf2转录因子在斑马鱼胚胎OS通路中的基因调控中起关键作用。所有脊椎动物的谷胱甘肽-S-转移酶（GST）基因编码的蛋白家族催化谷胱甘肽与亲电试剂的结合，在Nrf2激活的转录所必需的调控区域中也具有类似EpRE的序列。迄今为止，对Nrf2-Keap1系统调控的研究主要集中在靶基因和下游保护途径成分上。然而，使用Nrf2靶基因（如gstp1）或包括gstp1、hmox1a或fthI在内的全套原位杂交靶基因进行的OS分析仅限于表达这些单个基因的组织，而外源制剂可能激活整个生物体内的Nrf2。因此，必须测试众多基因以鉴定一种化学品的毒性特征，从而增加了分析每种化合物的细胞ReDox特征所需的工作量。利用迄今开发的ROS清除蛋白的转基因系，如Hyper3，具有相对较低的敏感性，并且仅限于高细胞应激实验，如尾部横切。最近，通过瞬时mRNA注射已在斑马鱼中应用了其他开发用于基于细胞的测定的氧化还原传感器，但是对于用于评估环境或药物相关应激源的研究，这些传感器既不稳定也不敏感。考虑到这一点，提供一种模型来检测通过nrf2操作的细胞氧化还原状态的不平衡性，作为整个机体抗氧化防御的主调节器，将提供一种量化暴露于氧化应激诱导物质和条件的影响的有力手段。此外，斑马鱼除了在环境毒理学中的应用外，主要是由于其与人类具有高度的遗传相似性，是生物医学研究中一种重要的非哺乳动物模型。事实上，至少70%的人类基因至少有一个斑马鱼同源基因，82%的人类疾病相关基因至少有一个斑马鱼同源基因。此外，斑马鱼的基因组通过morpholinos、mRNA和质粒注射的敲除/敲入实验，或者更准确地说，随着CRISPR-Cas9基因编辑技术的出现，可以进行测序和编辑。在这里，我们旨在开发一种不受组织特异性表达谱限制的斑马鱼OS生物传感器，用于筛选水生污染物和新型生物医学药物。我们假设使用EpRE作为OS细胞反应的全局标记，我们将观察具有高检测灵敏度的化学依赖性组织表达谱。我们通过暴露于五种与环境和/或生物医学有关的化合物来测试我们的模型，已知这些化合物通过特定组织的氧化机制发挥毒性。

 

方法：使用现有的野生印度斑马鱼（WIK），生产转基因斑马鱼和繁殖。为了产生转基因鱼，在1细胞早期阶段收集卵，将胚胎放在28°±1°C的Petri培养皿中，直到将其用于药物暴露和随后的成像。所有的胚胎都在E3培养基中培养。

 

EpRE-mCherry转基因品系：以下结构用于我们的构建体：三个串联重复的EpRE，与hsp70最小启动子，mCherry和polyA序列相结合，两侧是miniTol2序列。采用了三个EpRE串联重复序列来增强灵敏度。 该构建体由GeneArt生成，并置于pMX载体中。将pMX Tol2-3EpRE-hsp70-mCherry-polyA-Tol2质粒（25μng/μL;1μnL体积）连同转座mRNA（25μng/μL）注入早期1细胞期WIK卵中，并将其培养至成年。这些动物组成了始祖成年一代（F0）。通过与WIK鱼杂交来鉴定携带转基因的F0个体，并最终建立了三个独立的稳定Tg（3EpRE：hsp70：mCherry）品系，随后对F2和F3代进行了实验。

 

在三个Tg（3EpRE：hsp70：mCherry）品系中进行感应测试：为了测试在稳定的转基因个体中诱导EpRE构建体的能力，我们对开发的所有三个系进行了已知诱导氧化应激的谷胱甘肽抑制剂的研究，该抑制剂已知可诱导氧化应激并因此代表适当的阳性对照物质。独立的转基因品系均以相似的方式对总体氧化应激诱导剂作出反应。随后，我们采用1号线作为主要实验线，因为它呈现了最低水平的基线背景活动，可潜在地提高了检测组织特异性氧化应激的灵敏度。

 

化学处理：使用改良的E3培养基制备所有化学溶液，并如上所述平衡pH，以确保pHNBS为7.0（±0.05）。为了评估转基因品系对氧化应激的特异性和敏感性，我们将其暴露于一系列化学物质和重金属中，重金属已知会诱导哺乳动物的组织特异性氧化应激。在所有病例中，使用浓度范围来显示剂量反应性和评估模型敏感性。这些浓度范围被设计为包括基于来自文献的先验信息和关于这些化学品的吸收和毒性的内部数据的从很少/无应答到氧化应激的可能范围。它们是：马来酸二乙酯（DEM）； 对乙酰氨基酚（APAP）; 顺铂（Tocris）; 苯肼（PhZ）; 和Cu 2+（以CuSO 4·5H 2 O计量）。将CuSO4·5H2O直接添加到E3培养基中。 将所有其他物质溶解在与0.5％二甲基亚砜（DMSO）混合的E3中，这也用作我们的媒介物对照。在使用前24小时内制备溶液，并保持在4°C，直到使用前调整到28°C。用细镊子对健康的2 dpf幼虫进行去绒毛处理，然后分别在24孔微型板中暴露48h（从2dpf到4dpf），暴露于不同浓度的试验物质下。对于已知会粘附在塑料上的Cu2 +，将鱼幼虫暴露于1.2 mL的单个玻璃小瓶中。在规定的暴露时间后，幼虫通过过量的MS-222安乐死。所有实验进行了3次，每个实验分别用一批胚胎，新鲜化学药品进行，每个处理浓度重复5次（每种暴露浓度的总n = 15）。选择样本量是为了平衡最小化的动物使用和荧光检测复合效应的统计严谨性。对于每种受试物，我们分别对5只动物进行了3个实验。优化成像时间，以捕捉治疗反应，同时尽量减少动物应激。

 

分析化学：从平行暴露中收集培养基和幼虫样本，以评估暴露期间的化学稳定性和暴露幼虫的化学吸收。细胞Na + K + ATPase的免疫组织化学：通过使用小鼠抗Na + K + ATPase抗体对皮肤离子细胞进行阳性鉴定。神经肥大染色：为了鉴定阳性神经干和/或支持细胞，将活体幼虫用核酸染料SYTO24染色。在48小时顺铂暴露后，在成像前，取下治疗溶液，用等量的SYTO24（5?nM，0.1%DMSO，E3）染色液代替3min。然后，在植入和成像前，用E3培养基冲洗胚胎（3×）。

 

成像和图像分析： 简而言之，在暴露后，将幼虫在0.4μg/ mL的MS-222中麻醉，并置于在也含有0.4μg/ mL的MS-222的E3培养基中制备的0.7%低熔点琼脂糖中。获得幼虫全身图像，整个幼虫的Z层被分段拍摄，图像用一个定制的焦点叠加和缝合框架“stacknstitch”进行处理。使用Fiji（imageJ）对mCherry表达进行量化，方法是追踪单个器官并测量该区域的像素强度。对于Cu2+，通过免疫组织化学鉴定应答细胞，并在卵黄囊表面的标准区域计数。

 

结果：3EpRE：hsp70：mCherry转基因模型：产生了三个表型离散的稳定F0转基因系，每个系在没有应激源的情况下表现出低水平的mCherry表达（从受精后2天开始检测，或dpf）。其中，1号系的幼虫在未经处理的动物中表现出最低的基线mCherry表达水平，因此该系用于随后的化学暴露试验。暴露于已知会抑制谷胱甘肽合成的DEM（阳性对照）显示，响应的组织范围广泛，与该化学物质的氧化应激诱导的毒理学特性相符。随后暴露于四种具有不同毒性谱的附加化合物能够显示与哺乳动物报道的器官特异性和浓度依赖性OS反应。这些数据共同支持小鼠和斑马鱼之间的OS反应级联中EpRE序列和相关的Nrf2信号通路的功能保守性。除了哺乳动物暴露后的表达谱外，我们还鉴定了一些化合物的表皮、离子调节和前庭听觉组织反应，进一步说明了我们的Tg（3EpRE:hsp70:mCherry）斑马鱼系在检测新的OS相关机制方面的用途。我们的稳定转基因斑马鱼品系与以前的模型相比，在检测对Nrf2激活物的生物反应方面提供了重大进展，在以前的模型中，反应仅限于单个组织（例如嗅觉区域）。品系自诞生以来，已经在四代中显示出稳定且可诱导的荧光信号。从长远来看，通过冷冻1号系F4代的精子可以保证系的稳定性。然后，该系可以周期性地回到原始来源，从而避免因退化、近亲繁殖和/或突变而发生遗传变化。该品系幼虫能提供器官特异性荧光可视化。但是，3EpRE：hsp70：mCherry转基因的反应能力应持续到成年。 这增加了评估成人对氧化损伤的反应的可能性，这可以通过使用mCherry抗体进行冷冻切片/组织学和免疫组织化学来实现。

 

马来酸二乙酯（DEM）：暴露于DEM（8.7μM DEM）后，神经乳突和嗅窝的毛细胞，以及前肠和中肠的mCherry荧光均升高。在17.2μM DEM时，前肾管、肝脏和皮肤也有反应。使用35.9μM DEM时，mCherry荧光在所有组织，尤其是皮肤中更为明显。在肝脏中，荧光呈浓度依赖性，与相应的未经处理的对照组（0.5%DMSO）相比，所有处理组的荧光均显著升高。

 

对乙酰氨基酚（APAP）：在哺乳动物中，已知APAP过量会导致OS介导的肾毒性和肝毒性。在这个反应级联中，一种高活性的醌中间代谢物APAP，N-乙酰基-p-苯醌亚胺（NAPQI）消耗谷胱甘肽和硫酸盐的储存，并与细胞蛋白结合，导致线粒体功能障碍、OS和DNA损伤。过量的NAPQI也会引起白细胞和一系列炎症介质（包括ROS）的肝浸润增加，从而进一步导致肝损伤。Tg（3EpRE：hsp70：mCherry）鱼中，APAP处理导致荧光升高，主要在肝脏和前肾近曲小管中，反映哺乳动物的靶组织。在两个器官中，反应在肝脏中呈浓度依赖性，与DMSO对照组相比，mCherry在所有浓度下均显著高于DMSO对照组，并且在各处理之间也有显著差异。以前也已证明APAP暴露会引起斑马鱼的肾脏毒性，在这里，我们首次首次提供了证据，证明通过激活前肾中的EpRE元素，氧化应激介导的毒性途径。

 

顺铂：在哺乳动物中，暴露于烷化剂和化疗药物顺铂的肾毒性是一个复杂的多因素过程，其部分原因是由于肾小管细胞中多种信号通路的激活，包括细胞谷胱甘肽的耗竭和线粒体功能的干扰。此外，顺铂也是众所周知的耳毒性剂通过ROS介导的机制，结合到耳蜗的NOX-3。顺铂激活NOX-3，增加超氧化物的产生，导致谷胱甘肽的消耗和一连串的事件最终导致耳蜗细胞凋亡。Tg（3EpRE:hsp70:mCherry）斑马鱼在顺铂暴露后，前肾近曲小管mCherry呈浓度依赖性诱导。顺铂进入幼虫体内的摄取量相对较低（占培养基的3-4%），但仍呈浓度依赖性，与所见的生物反应一致。因此，在前额叶的特定子区域中观察到的ROS反应与已建立的哺乳动物顺铂的肾毒性和斑马鱼先前报道的近端小管损伤一致。

 

PhZ：在哺乳动物中，PhZ的血液毒性机制被认为是通过H2O2的形成及其随后与红细胞的相互作用而引起的。 PhZ的氧化形式可直接使血红蛋白变性，并诱导红细胞膜脂质的过氧化。显示暴露于PhZ的Tg（3EpRE：hsp70：mCherry）斑马鱼幼虫在循环红细胞中显示mCherry荧光的增加。共聚焦显微镜分析尾动脉标准化节段显示，PhZ对表达mCherry的红细胞数量有显著影响。

 

铜：众所周知，水和饮食中暴露于重要的环境污染物铜（Cu2 +）都会导致鱼的氧化应激。Cu2 +毒性的机制涉及ROS的产生，该ROS的产生是由于干扰金属的运输和螯合过程，以及通过化合价的变化直接生成自由基。在稳态下，过渡金属离子对ROS的破坏通常可通过抗氧化剂包括金属硫蛋白和铁蛋白来防止。与对照动物相比，暴露于Cu2 +导致暴露的幼虫中离子细胞的数量显着增加，其中这些暴露的离子细胞中有64％也表达EpRE-mCherry信号。离子细胞的这种增加可能是一种机制，以抵消Cu2 +对现有离子细胞中Na2 +通道的阻滞作用，而mCherry信号表明这些细胞正在遭受氧化应激。

 

结论：我们开发了一种新的稳定的转基因斑马鱼，它使用EpRE作为细胞对氧化应激反应的整体标记，从而避免了以前的Nrf2聚焦细胞系的组织限制性表达。 使用该模型，我们显示组织特异性和浓度依赖性反应，以众所周知的五个化合物诱导氧化应激，从而支持环境和人类健康应用的系统和模型的适用性。我们的鱼品系首次能够监测是否存有化学物质或状况，何时何地导致细胞RedOx失衡，因此提供了一种新的强大方法来进一步了解广泛的人类健康和环境状况。此外，通过使用我们的模型和构建体设计，可以对氧化还原敏感转录因子及其在病理中的相互作用作用之间的串扰进行分析，从而进一步了解驱动OS的信号传导途径。