摘要：自体血小板浓缩物目前广泛用于再生医学的不同领域，以增强伤口愈合过程。虽然有几种血小板浓缩物的方案可用，但由于不同的方案导致不同的产品具有不同的潜在生物学用途，因此它们的应用仍然很困难。在本研究中，我们尝试使用富血小板血浆（PRP）注射和富血小板纤维蛋白（PRF）的混合物制作血小板贴片（PP），以促进伤口修复和再生。结果：实验采用小型猪全层创面模型。在猪的四处全层皮肤伤口形成前制备自体PRP、PRF和PP。我们量化血小板、凝血酶和各种生长因子的浓度，以确保产生预期的效果。术后应用亲水胶体敷料、PRP注射液、PRF和PP治疗实验性创面。通过测量创面大小和组织学检查评价其应用效果。结果表明，所有伤口均明显缩小。与PRP和PRF相比，P P治疗后的创面修复效果明显增强，创面收缩率明显高于PRF治疗。另一方面，以DsRed转基因猪为供血者的实验表明，PP中的白细胞在研究结束时被整合到伤口床中，这表明PP的应用刺激了白细胞活性。器官活检检查也证实了实验过程的安全性。结论：使用小型猪模型来评估实验室制备的聚丙烯对诱导的全层伤口愈合的效果。结果表明，在伤口护理中，使用一片PP足以获得与一般使用PRP或PRF相当的疗效。我们还证明了PP中的白细胞被整合到伤口床中，并且在整个实验中没有发现安全问题。本研究为兽医或临床伤口护理提供了一种新颖可行的方法。

 

 

背景：伤口愈合非常复杂，涉及到一系列有序的生理和分子事件。此过程始于止血，然后是炎症，细胞募集，迁移，增殖以及组织重塑和成熟，这些过程受多种细胞，细胞因子和生长因子的调节。在慢性伤口中，愈合因全身或局部因素而停滞，如糖尿病、静脉或动脉疾病、持续感染和潜在的代谢缺陷。无论伤口类型如何，对于寻求改进策略和敷料的伤口护理专业人员来说，实现高效和最佳的伤口愈合仍是一项重大挑战。富含血小板血浆（PRP）是一种由血小板和高浓度生长因子组成的血液衍生组分，在促进运动损伤后肌肉恢复、促进急慢性溃疡创面愈合、肌肉骨骼组织再生等方面受到广泛关注。自体PRP的一般制备方法采用一或两次离心，第一次离心产生三层，其中包括底部的红细胞，由高浓缩血小板和白细胞（PRP）组成的血沉棕黄层的中间层以及缺乏血小板血浆（PPP）层。在第二次离心之前，先去除上部的两层，然后再去除大部分的PPP层，以获得高度浓缩的血小板（PRP）层。然后加入凝血酶和钙以激活纤维蛋白原聚合，从而形成嵌入纤维蛋白网络中的浓缩血小板凝胶并准备使用。自体PRP使用和临床功效的当前标准是指其血小板浓度（> 106血小板/μL）和生长因子浓度增加3至5倍。迄今为止，已经开发了许多即时护理准备方案和设备。 富血小板纤维蛋白（PRF）是Dohan等人开发的第二代浓缩血小板。与PRP相比，PRF是在不使用抗凝剂的情况下通过一次离心制备的，全血凝血酶在离心过程中触发血小板活化和纤维蛋白原聚合形成纤维蛋白凝块。在这种凝块中，血小板与细胞因子、生长因子和白细胞一起被浓缩，从而在愈合和组织再生中产生最大功效。强机械强度的PRF保护生长因子免受蛋白质分解，支持延长释放。PRF已在许多领域中得到利用，以增强软组织，慢性腿部溃疡的愈合并促进骨骼再生并取得积极成果。利用PRP和PRF进行伤口护理的巨大兴趣得到了以下理论的支持：血小板是各种生长因子的贮存库，这些生长因子对组织修复和再生至关重要，并且在创伤中具有抗菌特性。因此，本研究的目的是将PRP与PRF结合形成一种新的材料，即血小板贴片（PP），并与传统的PRP与PRF进行比较。还将使用这些血小板衍生产品的伤口愈合与使用商业化的水胶体敷料的当前治疗进行了比较。在动物中创建全层皮肤伤口是研究PRP愈合效果的理想模型。在这项研究中，我们在小型猪中创建了全层伤口，作为急性伤口愈合的模型。 猪和人类皮肤之间的相似性使小型猪成为探索人类皮肤伤口愈合的准确模型。在使用前确定血小板和生长因子的浓度，并进行客观伤口大小测量和组织学检查以评估不同治疗的疗效。在研究结束时，用免疫荧光染色和免疫组织化学方法检测PP中的白细胞，以确定它们在创面床上是否存活。我们在这项研究中也进行了安全性验证。

 

方法：六只小型猪，其中包括两只携带上述DsRed-单体报告基因猪，年龄约4月龄。自体PRF膜，PRP注射液和血小板贴剂（PP）的制备：从每头小型猪颈内静脉中抽取40毫升全血，立即用于制备自体PRP、PRF和PP。为制备PRF膜，在台式离心机上以1300×g离心8ml全血15min。产生三层，包括底部的红细胞、中间的结构性纤维蛋白凝块和顶部的无细胞血小板缺乏血浆（PPP）。收集纤维蛋白凝块，将其压在两块纱布之间，制备成可使用的PRF膜。收集含有自体凝血酶的渗出液，与注射器一起使用。为制备PRP注射液，将32ml全血在650g下离心5min，形成三层。然后，将PPP的顶层和血沉棕黄层的中间层（BC）都转移到新的无菌试管中，以1300xg的速度进行第二次离心15分钟。产生了三个新的层，其中顶部的大部分PPP被移除并用于其他地方，而剩余的PRP（一些PPP+BC+残余红细胞，1 mL）被来自方案1的0.5 mL自体凝血酶激活以产生PRP注射液（方案2）。PRP注射液（1.5ml）用于伤口周围直接注射。在这项研究中，我们将PRP与PRF结合使用以生产用于伤口治疗的血小板贴片（PP）。 为了制备PP，用5 mL PPP（在方案2中收集），1 mL葡萄糖酸钙和2 mL自体凝血酶（来自方案1）激活PRP（1 mL）。将混合物轻轻摇匀，然后转移到培养皿中。接着，加入PRF膜，10分钟后，将凝胶产品压在两个银色敷料之间，形成一片PP（方案3）。

 

凝血酶浓度的测定：用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定PRF膜和纤维蛋白凝块渗出液中凝血酶的浓度。生长因子浓度的测定：用ELISA试剂盒定量检测活化PRP中血小板衍生生长因子（PDGF）、转化生长因子β1（TGFβ1）和表皮生长因子（EGF）的含量。

 

小型猪全层皮肤创面的形成及后续处理：一个月后，六只小猪的平均体重为26.6±4.1公斤，因此，要创建一个全层创面。手术前，用氯胺酮/二甲苯嗪（KX）镇静麻醉小型猪，然后吸入麻醉，并抽取40毫升全血，制备每种浓缩血小板。去除小香猪背部毛发，用洗必泰清洗皮肤。如图7所示，在距脊柱3cm的躯干右背外侧区域，用无菌墨水划出两块3×3cm2，间隔6cm的正方形，然后用15号手术刀制造两个平均深度为1.5±0.2 cm的全层伤口，同时不损伤下一层肌肉。手术后，猪被分成三对。在每对猪中，第一只猪在伤口上部位置（治疗H）涂上Comfeel?水胶膜，在伤口下部位置（治疗PP）涂上一片PP。第二只猪上部位置的伤口处接受1.5 mL PRP注射（治疗PRP），下部伤口处施以PRF膜（治疗PRF）。在伤口边缘0.5cm处伤口周围6-8个不同点注射PRP，将PP、PRF膜和市售水胶膜直接放置在伤口上，制备PRP注射液、PRF膜和PP所用的血液均来自接受治疗的同一头猪。实验期间进行了动物福利相关的评估和干预，包括形态学、生理学、行为学、饮食摄入、耗水量和一般健康状况。随后，所有伤口进一步覆盖薄膜敷料和泡沫敷料，以避免脱水和伤口床的微生物污染。.最后，每头猪每公斤体重给予0.03毫升普鲁卡因青霉素G（30万IU/mL；）每日1次，连续3天。同样的实验进行了两次，间隔时间>3个月（n=3×2）。

 

伤口愈合评估：在第3、6、9、12和14天（研究结束）用数码相机记录伤口愈合过程。从垂直于伤口表面拍摄的照片中测量伤口，并在伤口的同一平面上放置一把塑料尺，以比较它们的实际尺寸。第x天的伤口大小通过使用free ImageJ软件绕伤口边缘计算，伤口愈合通过根据以下公式计算伤口收缩百分比来评估：在第X天（％）的伤口收缩＝ [1-Adayx / Aday 0]×100％。

 

组织学检查：在研究结束（第14天）时，对包括周围非损伤皮肤在内的伤口活检进行切除、固定和石蜡包埋。组织切片用苏木精和伊红（H&E）试剂染色。组织学评价指标包括炎症、表皮细胞碎片、血管生成、肉芽组织和再上皮化。炎症和表皮细胞碎片根据病变程度从1到5分，分为：1分，最小（<1%）；2分，轻微（1-25%）；3分，中等（26-50%）；4分，中等/显著（51-75%）；5分，显著（76-100%）。血管生成，肉芽组织和上皮再形成根据Altavilla等人的标准从1到4分级。每个参数的得分平均来自六个独立的实验。

 

免疫荧光和免疫组化分析：在PRP和PRF的制备过程中，离心后大量的血小板和白细胞被包裹在棕黄色的外套中或嵌入到纤维蛋白凝块中。 为了确定这些白细胞在研究结束前是否仍留在伤口床上，我们使用DsRed转基因小型猪作为献血者，然后将其制备的PRP、PRF和PP应用于同一血型的非转基因产仔受者的全层伤口。通过混合供体和受体血液预先确定血型，并且在没有凝集的情况下，得出的血型相同。 除血源外，其他步骤与上述方法相同。伤后14天取伤床皮肤活检在充分固定和石蜡包埋后，切取组织切片，分别用兔抗DSDRE原抗体和FITC缀合物和过氧化物酶缀合的次级抗兔抗体进行免疫荧光（IF）和免疫组化（IHC）染色。

 

安全性验证：实验结束后，随机抽取一对小型猪，静脉注射过量戊巴比妥钠（100mg/kg）进行尸检，以确定本实验方法的安全性。对心脏、肾脏、肝脏、肺、胰腺、脾胃等器官进行了病理学检查。

 

结果：PRP和PRF膜中血小板、凝血酶和生长因子的浓度：预先确定活化的PRP中的血小板和重要生长因子的浓度，以确保在伤口上施用的功效。在激活的PRP中，新鲜采集的全血血小板浓度在136×103~412×103血小板/μL（平均283 ± 112 × 103）和2474×103~3628×103血小板/μL（平均2868±447×103）之间变化。在激活的PRP中血小板浓度显著增加，使用目前的PRP收集方案获得平均10倍的增加。 此外，活化的PRP中的生长因子浓度对于PDGF-AB为109至148 ng / mL（平均125.8±15.3），对于TGF-β1为51–60 ng / mL（平均55.8±3.3），以及对于EGF为2.8–7.5 ng / mL（平均6.1±1.8）。根据方案1，离心后形成纤维蛋白凝块。然后按压纤维蛋白凝块产生PRF膜和渗出液。PRF膜凝血酶浓度为62～88ng/mL（平均73.0±9.7），渗出液凝血酶浓度为65～84ng/mL（平均75.2±7.1）。

 

自体血小板浓缩物对创面愈合的评价：所有伤口在开始时大小相似（9平方厘米），在研究结束（第14天）前每隔3天测量一次伤口大小。结果表明，各组的伤口大小逐渐减小，两组之间没有显著差异。伤口尺寸的实际测量如图2b所示，显示所有组的伤口尺寸都显著减小。术后14天，H组平均创面面积为1.11±0.17平方厘米，PRP组为1.52±0.22平方厘米，PRF组为1.67±0.32平方厘米，PP组为1.17±0.15平方厘米。与第0天相比，H组伤口收缩率为87.7±1.9%，PRP组为83.1±2.5%，PRF组为81.4±3.6%，PP组为87.0±3.0%。

 

伤口愈合质量的组织学评估：在第14天，根据炎症程度、表皮细胞碎片、血管生成、肉芽组织和再上皮化对伤口愈合进行组织学评估。所有组的炎症程度和表皮细胞碎片的评分为2-4，显示轻度至中度/标记，无显著差异，尽管PP组的炎症相比其他组有所减轻。 肉芽组织的形成是增殖阶段的主要事件，大约在受伤后4天发生。在研究结束时，在每个疗程的所有皮肤切片中都观察到大量肉芽组织，评分从3到4。血管生成是另一个发生在增殖期的重要事件，是维持新生肉芽组织的必要条件。每组的大多数组织学切片均显示出轻微的血管生成（评分= 2）。 在所有组中也观察到上皮再形成，得分为1至2。 然而，与PRP和PRF组相比，PP组的得分明显更高。

 

白细胞在伤口床上的存活率：在我们的实验方案中获得的PP浓缩物由大量的血小板和白细胞组成。 在使用DsRed转基因小型猪作为献血者的实验中，抗DsRed抗体识别伤口床肉芽组织中的一些细胞，通过与FITC偶联的二抗偶联显示为绿色。通过将含DsRed的细胞染成棕色，IHC结果也与免疫荧光一致。 这些结果表明，所制备的血小板浓缩物中所含的白细胞在施用后存活至少14天。

 

安全性验证：研究结束后，一对小型猪被处死进行安全性验证。本研究结果显示，小型猪的心脏、肾脏、肝脏、肺、胰腺、脾胃等脏器切片均未发现病理特征，说明本实验室生产的PRP、PRF、PP产品及所示的制备方法是安全的，可用于临床应用。

 

结论：在本研究中，我们成功地建立了小型猪的全层创伤模型，以评估用PRP注射和PRF纤维蛋白混合物制作的实验室血小板贴片（PP）促进创伤修复和再生。PP治疗后的创面修复效果表现为再上皮化增强，创面收缩加快。以DsRed转基因猪为供血体，进一步证明PP中的白细胞被整合到创面床中。。 通过检查器官活检证实了实验过程的安全性。 在这项研究中，仅用一片PP覆盖伤口，表明如果使用更多的PP可以改善愈合效果。因此，本研究为兽医或临床伤口护理提供了一种新颖可行的方法。