一、实验目的

制备小鼠脊髓挫伤模型，研究脊髓损伤后小鼠行为学和形态学的变化，为研究损伤后的修复策略及生物分子机制提供参考。

二、实验原理

Allen建立的重物坠落致脊髓损伤的方法适用于大鼠和小鼠，前一节已经介绍过使用该方法制作大鼠脊髓挫伤模型，本节介绍运用该方法建立小鼠脊髓挫伤模型。如前所述，这种模型比较接近人类脊髓损伤的病理生理特点及变化规律，为研究脊髓损伤后人类行为学和形态学的变化提供了依据。

三、实验材料与方法

(一)实验材料

1.所需设备  重物坠落打击仪(自制)；电热压力蒸汽灭菌器；微量电子天平；电热恒温鼓风干燥箱；水平电泳仪；电热蒸馏水器；20μl、100μl、200μl、1000μl可调微量加样枪；手术器械：眼科剪、解剖剪、蚊式钳、有齿镊、无齿镊。

2.所需试剂  3.6％水合氯醛，75％乙醇，碘伏，8U/ml青霉素钠，生理盐水，葡萄糖溶液。

3.试剂配制  3.6％水合氯醛溶液：称取0.36g的水合氯醛溶于10ml的蒸馏水中，混匀，现配现用。

(二)实验方法

1.小鼠脊髓挫伤模型制备

(1)实验动物及饲养环境：采用C57BL/6J小鼠，雌性，2～3月龄，体重为(25±5)g。实验动物饲养室的温度为18～19℃，相对湿度为40％～70％，每小时换气10～20次，噪声在60dB以下，每立方米空气中氨在14mg以下，工作照度为150～300lx。每天喂料、喂水，垫料每周更换2～3次，造模损伤后分笼饲喂。

(2)脊髓损伤：右下腹剃毛消毒，于腹股沟中点上方0.5cm进针，3.6％水合氯醛(1ml/100g)腹腔注射麻醉。麻醉过程中注意保温，助手详细记录每只小鼠的手术开始及结束时间，以及估计失血量，以便术后治疗、护理。

3～5min后，小鼠出现站立不稳，疼痛反应弱或者消失。将小鼠俯卧位固定，常规备皮，消毒铺巾，以T8、T9为中心，取一背部正中切口，长约1cm，逐层分离筋膜、肌肉，暴露T8～T10(第6～8胸椎)节段脊椎棘突，钝性分离T8～T10节段脊椎椎骨上的肌肉，咬骨钳咬除T8～T10节段棘突及椎板，暴露T10脊髓。选择2.5g金属棒在30mm处自由下落，打击T10神经节段。注意：打击前对金属棒进行消毒处理，并且打击后对脊髓损伤区进行清洗处理。脊髓损伤成功以鼠尾摆动和后肢回缩性扑动为标志。

术后处理：术后将动物分笼饲养，自然光照、通风；并勤换清洁、干燥的饲养笼垫料，始终保持干燥；被尿液浸湿的肢体及时用温肥皂水清洗，并用电吹风吹干；加强营养，喂食鸡蛋、葵花籽，由于动物下肢瘫痪，要及时将将饲料、饮水置于动物可及范围；严密观察动物精神状态、饮食、排尿排便、有无肢体水肿和压伤、有无泌尿系统血性分泌物等情况，并给予人工排尿每日3次；腹腔注射青霉素10万U/次，每日2次；预防自残；预防肠梗阻。

(3)脊髓损伤动物模型的评价：动物脊髓损伤后的功能评定包括运动功能评价、神经电生理评价和组织形态学评价。在本实验中采用运动功能评价和组织形态学评价。

采用Basso等提出的BBB评分体系评分，总分21分(见表2-1)，考查小鼠后肢的运动、躯干位置及稳定性、步态、协调性、爪的置放、足趾间隙及尾的位置，表示脊髓损伤和治疗后小鼠后肢运动功能恢复的过程。该评分简单直观，易于掌握，与脊髓恢复有极好的一致性。

损伤后动物分别在术后7d、14d、21d、28d评定。观察前排空膀胱，以免影响小鼠活动，而后将动物置于平坦不滑的实验台上，观察4min，对动物的躯体定位及后肢功能进行行为学评分。评分者为熟悉评分标准的非本组实验人员，由3人评分后取平均值。观察时间根据小鼠的活动习性定在20：00左右。

四、实验结果

小鼠在术后2～3h完全清醒，挫伤后所有小鼠均表现为完全截瘫，后肢及尾部无自主活动。损伤平面以下肌张力降低，对针刺等刺激无反应，提示挫伤造模成功。BBB评分结果显示脊髓损伤后评分降低，随着时间的推移逐渐有所恢复，结果见表14-2。

五、结果分析

小鼠脊髓挫伤模型能模拟人类脊髓损伤。通过构建动物模型，可以观察到脊髓损伤后 BBB评分降低，但在后期随着时间的延长，小鼠运动功能有部分恢复。说明低等啮齿类动物脊髓在受到不完全损伤后具有一定的自我修复能力。

六、经验与体会

构建动物模型，需要使其损伤的部位和程度一致，否则会导致模型不一致。

动物模型不能完全代表最终的临床试验，在时间和空间上存在其局限性。因此，设计动物模型时应尽可能地接近临床，并能有效地代表临床疾病。