阿尔茨海默病(AD)是一种由神经系统变性引发的退行性脑变性疾病和进行性痴呆。老年人发病率较高，并以65岁以上居多，约占老年期痴呆的2/3。临床表现以记忆障碍、认知功能障碍、精神症状。以及人格、行为方面的异常为主。典型的三大病理特征为：神经原纤维缠结、老年斑及神经元的广泛缺失。AD的动物模型按产生原因大致分为两大类：一是自发性动物模型，即由动物本身突变所致的AD相关病变，包括代谢紊乱、分子异常与特种蛋白质合成障碍等模型；二是诱发性动物模型，由人为施加物理、化学和生物等致病因素，诱发 AD相关征象。但AD的病因及发病机制尚未阐明，一般认为AD是复杂的异质性疾病，多种因素可能参与致病，如遗传因素、神经递质、免疫因素和环境因素等。现有的行为学研究海马依赖的认知功能及短期记忆功能异常的方法主要采用水迷宫、高架迷宫、条件刺激等。而临床AD患者表现出多样的记忆功能损失或低下。因此。研究开发具有多种记忆功能紊乱的AD动物模型具有重要意义。建立理想的动物模型以探索相关机制是AD研究中的重要内容，也是AD基础研究的突破点。目前，理想标准化的AD模型尚未确立，建立标准化 AD模型是进行动物实验研究的重要条件。

在数十年的主要研究中，淀粉样蛋白级联假说或β-淀粉样蛋白(Aβ)毒性的假说，假定 Aβ肽的沉积在大脑中是AD的核心事件。虽然AD不是公认的突出的免疫调节疾病，但越来越多的证据强调了免疫学机制密切参与AD的发生和发展。根据AD发病的免疫假说，当免疫功能发生紊乱时，Aβ代谢是中断的。随后，炎症和毒性损害神经级联反应发生，导致突触损伤，大脑中的神经元变性和死亡，并最终诱导AD的发生。鉴于Aβ的神经毒性作用，研究者将思路转向了Aβ脑内灌注，并在脑内沉积，从而建立痴呆模型，并通过HE染色观察海马组织细胞的形态学变化。

目前常用以研究AD的实验动物有：非人灵长类动物与啮齿类动物。遵循“减少、替代、优化”的选材原则。非人灵长类动物与人类的脑部解剖结构、神经病变特点及生物行为模式相似，尤其是恒河猴，在其脑中观察到含有Aβ沉积的老年斑和神经原纤维缠结现象，无论是自发还是诱发模型，都能够较好地复制AD相关的病理及生理特征，但是高昂的费用与稀缺的资源限制了非人灵长类动物的大量应用。啮齿类动物虽然在病变模拟方面不如非人灵长类全面，但是其具有价格低廉、资源广泛、生存率高等特点，与人类的脑部解剖结构与生理特征也较为相近，更适于诱导模型的大量制备，成为AD最常用的动物模型。本节主要介绍大鼠侧脑室注射Aβ1-40阿尔茨海默病模型的建立及行为学评估。

一、实验动物及分组

健康成年雄性SD大鼠24只，质量(300±20)g，月龄8周(由昆明医科大学实验动物中心提供)。大鼠分笼饲养，自由饮食，动物房温度21～25℃，相对湿度40％～60％，自然光照昼夜节律变化。饲养1周，同时用无菌生理盐水将Aβ1-40稀释成10μg/μl，37℃孵育1周，使其变为聚集态。在造模前进行Morris水迷宫训练。除去先天愚钝的大鼠，随机分为假手术组、AD模型对照组及模型运动训练组，每组8只。

二、实验所需试剂及器材

1.试剂名称  戊巴比妥钠，25g/瓶；0.9％氯化钠注射液，50ml/瓶；Aβ1-40，A1075；碘伏，500ml/瓶；青霉素，80万U/瓶；无菌生理盐水，200ml/袋。

2.器材名称  大鼠脑立体定位仪；婴儿理发器；电动自停开颅骨钻；计时器；智能恒温培养箱；一次性注射器；一次性乳胶手套；帆布手套；微量注射器；Morris水迷宫。

三、大鼠侧脑室注射Aβ1-40阿尔茨海默病模型的建立

对照组和AD组用0.4％戊巴比妥钠(0.2ml/10g)腹腔内注射麻醉，然后将其头部固定在立体定位仪上。剪毛备皮，碘伏消毒，沿头背中部纵向切口，暴露前囟，参照大鼠脑立体定位仪使用说明，选右侧海马为注射区，定位坐标：前囟后1mm，中线右侧1.4mm，硬膜下3.8mm。用颅骨钻在坐标点周围环形钻开颅骨，并分离暴露硬脑膜，微量注射器自此处缓慢垂直进针2.6mm，然后将1.5μl Aβ1-40缓慢注入大鼠右侧海马，留针5min，再缓慢撤针，缝合切口。假手术组则用同样的方法注射生理盐水。手术完成后注射青霉素0.2ml/100g。

四、模型的评估

(一)Morris水迷宫实验

将各组大鼠在正式训练前一天分别放入水中自由游泳2min。使其熟悉水迷宫环境。然后对各组大鼠正式进行Morris水迷宫测试，采用航行定位实验和空间探索实验分别测试大鼠的学习能力和记忆能力。

1.定位航行实验共5d  将大鼠从标记的4个入水点依次朝向池壁轻轻放入水中，采集大鼠在2min内寻找到并爬上平台所用的时间(平台在第3象限，平台低于水位2cm左右)，即逃避潜伏期(在站台上稳定10s算找到站台，否则继续记录)。如果大鼠2min内未找到平台，需将其牵引到平台，并停留60s，这时潜伏期记为2min。

2.空间探索实验1d  撤除平台，将大鼠放入水池中，记录大鼠在2min内在平台所放置的目标象限内停留的时间和穿越平台所在区域的次数。

(二)组织的准备

以浓度为20mg/ml的戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉，开胸、暴露心脏，将注射器通过左心室穿至主动脉，在右心房剪开一个小口，快速用生理盐水灌注，待全身血液排净，右心房排出透明液体后用4％多聚甲醛300ml灌注固定。取出脑组织放入4％多聚甲醛中固定4h，之后将组织进行乙醇系列脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋。将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成8μm厚的切片，放入45℃恒温培养箱中烘干。

五、实验结果

(一)大鼠侧脑室定位

本实验通过大鼠脑立体定位图谱找到侧脑室的三维立体坐标，依照查得的侧脑室坐标前后左右移动，进针注射可视墨汁，可见在大鼠的海马、胼胝体等处呈黑色。

(二)Morris水迷宫实验

经过Morris水迷宫实验测得，AD模型组的潜伏期延长，与假手术组和对照组比较有显著性差异(P<0.05)。在穿越站台次数上，AD模型组明显少于其他两组，AD模型组与假手术组和对照组均具有显著性差异(P<0.05，图15-1)。

六、注意事项

(1)在开始实验前，实验者应与受试动物建立良好的感情，让动物熟悉实验者的身体信息，如气味、相貌等。捕捉动物的动作要温柔，忌讳手抓鼠尾，以免过分刺激动物。鼠的嗅觉很敏感，在实验过程中应当避免使用较强气味的化妆品或香水。另外，如果大鼠能够看到实验者。在水迷宫实验过程中，实验者或者躲藏或者保持固定位置，避免造成大鼠能够看到的人体移动。

(2)水池不能太小，站台也不能太大，水池太小或站台太大都会增加大鼠随机上台的概率，出现假阳性结果。目前大鼠Morri水迷宫的直径大多为1.2m或1.6m，本实验所采用的直径是1.6m。

(3)水温对逃避潜伏期影响很大：如果温度过高，大鼠游几次后渐渐适应迷宫环境，就把迷宫当成“浴盆”，在泳池中漂浮不动；如果温度过低，大鼠体温下降很快，体力也会耗散太多，游泳时间不能坚持很久，就会出现游几次逃避潜伏期突然增大的现象。所以要保证水温在23～25℃。

(4)要保证Morri水迷宫水面上没有光影，主要是避免光线在水面的反射，以免留在水面的光照影子被软件的采集系统混淆为大鼠的影子，影响最终自动分析大鼠中心点。将屋子里的灯都关掉，窗帘都拉上，切断光源。

(5)尽量保证实验室内所有大鼠能够看到的外部参照物在实验过程中位置固定。

(6)大鼠水迷宫训练完成后要用干布擦拭，并用烤炉烤干。

(7)用颅骨钻开颅时，注意颅骨表面的筋膜是否处理干净，否则会损伤脑组织和表皮，并注意颅钻深度。

(8)侧脑室注射时一定要严格遵守进针/退针的深度及停针时间，并在推注过程中一定要遵循匀速缓慢原则，否则可能导致动物死亡。

(9)术后腹腔注射青霉素预防感染，45°进针后回抽，见空气后方可进行注射。若出现血性或其他液体(可能是尿液)，则退针重新进行注射。