AD是一种与衰老相关，以认知功能下降为特征的渐进性脑退行性的疾病。AD患者整个大脑弥散性萎缩并出现明显的病理组织改变——老年斑和神经原纤维缠结，并伴神经元减少。其中以基底前脑海马区胆碱能神经元受累最严重。它的临床表现为进行性精神状态衰退。包括记忆、智力、定向、判断能力、情感障碍和行为失常甚至发生意识模糊等。目前，在我国60岁以上人群中，AD患病率约为1.6％，并且随着人口老龄化而日趋明显。同样，Tog- noni等对65岁以上的老年人进行调查。其结果显示患病率为4.2％。事实证明阿尔茨海默病已经成为继心脏病、肿瘤、脑卒中之后，能引起成人死亡的主要疾病。有研究报道显示，利用Morris水迷宫作为动物空间学习和记忆能力的检测。并未关注过Morris水迷宫重复训练对穹隆-海马伞通路切断大鼠本身的空间学习和记忆能力的影响。双侧穹隆-海马伞通路切断大鼠建立的动物模型。其机制在于损伤隔区胆碱能神经纤维至海马与皮质的投射，从而破坏胆碱能诱发动物学习、记忆障碍。而海马伞是保持胆碱能神经在内的脑神经通路通畅和中枢胆碱能功能正常。最终维持认知功能和学习记忆能力正常的物质。海马伞是中隔胆碱能神经元到达海马的主要神经纤维，如果将穹隆一海马伞通路切断，海马区、皮质区到 Meynert核区的逆行运输就会受到阻断。因此，建立穹隆-海马伞通路切断阿尔茨海默病模型对阿尔茨海默病的治疗与研究有一定的意义。

建立AD动物模型的方法很多。其中损坏大鼠脑内胆碱能神经可以造成其远端区域失胆碱能神经支配，影响学习、记忆等认知过程，有报道认为以此可以部分模拟阿尔茨海默病的病理改变。其中穹隆一海马伞通路切断是模拟AD的有效方法。因此，作者选取了切断穹隆-海马伞通路来建立AD模型，此方法主要通过切断隔-海马通路，破坏胆碱能纤维传入，导致实验动物行为及神经化学方面的缺损，造成动物空间定向和记忆障碍及胆碱能神经元的丢失。JeItsch等报道，切断穹隆-海马伞通路造成的AD模型在数月后其行为及神经化学的缺失也不能恢复。对此AD模型大鼠进行了行为学测试，证实大鼠的学习与记忆的获得与再现均受损。

一、实验分组

实验用中山医科大学实验动物中心提供的SD雄性大鼠，体重(300±50)g。先对所有大鼠进行迷宫训练，筛选出达到学会标准的大鼠(学习记忆正常鼠)，再将其随机分成3组(n=8)。①实验组：横断穹隆-海马伞组(FF)。②对照组：8只，开颅并挑开硬脑膜，切断皮质、胼胝体，但不切断穹隆-海马伞。③正常组：8只。建模后第12天再次进行迷宫检测。

二、实验所需试剂及器材

1.试剂名称  戊巴比妥钠，25g/瓶；0.9％氯化钠注射液，50ml/瓶；Aβ1-40，A1075； PBS，1L/包；碘伏，500ml/瓶；青霉素，80万U/瓶。

2.器材名称  大鼠脑立体定位仪；婴儿理发器；牙科钻；计时器；自制洞板；智能恒温培养箱；不锈钢灭菌器；一次性注射器；一次性乳胶手套；帆布手套；微量进样器(10μl)。

三、穹隆-海马伞通路切断大鼠模型的建立

用1％戊巴比妥钠(35～40mg/kg)麻醉大鼠后，将大鼠固定于江湾Ⅰ型C立体定位仪上，常规消毒、剪毛，正中切开头皮，暴露出颅骨，参照Paxinos和Watson大鼠脑立体定位图谱，在前囟后2.2～2.5min、中线向两侧旁开1mm处，用电动开颅钻凿开颅骨，切开硬脑膜，置自制开颅刀片于该部位脑表面，接着降刀4.5mm、外移1min，再降刀1mm、外移1.5mm，上下抽刀20次，保证海马伞外缘完全离断。为了排除横断皮质对实验所带来的影响，同时设置了对照组，即将双刃刀片置于上述脑表面后只降刀4.5mm并外移1mm，而不继续损伤其他部位。

四、Morris水迷宫

Morris水迷宫作为检测实验动物学习、记忆水平的重要工具，其测试程序主要包括定位航行实验和空间探索实验两个部分。①定位航行实验(place navigation test)：用于测量大鼠获取经验(学习)的能力。实验前1d下午将大鼠放入水中自由游泳2min，观察其游泳姿势并使其熟悉实验环境。实验历时4d，每天上午、下午两个时间段，每个时间段训练4次，每次训练随机选择一个入水点，将大鼠面向池壁放入水池，同一次训练所有大鼠入水点相同。每只大鼠在训练前放于平台120s以熟悉水迷宫及周围环境。记录大鼠找到平台的时间，即逃避潜伏期。至120s找不到平台者，则将其引上平台，潜伏期记为120s，大鼠每次爬上平台或被引上平台后，让其在平台上休息60s。将每一时间段内4次潜伏期的算术平均值作为这一时间段的学习成绩。②空间探索实验(spatial probe test)：用于测量大鼠保存经验(记忆)的能力，即大鼠学会寻找平台后，对平台空间位置记忆的能力。在训练的最后时段撤除平台，然后在第2象限任选一个入水点将大鼠面向池壁放入水中，观测其在120s内在各象限的游泳距离及其占总距离的百分比；以及120s内穿越各象限平台相应位置(即平台在第4象限所在的位置)的次数。

五、实验结果

(一)定位航行能力

在一定范围内，大鼠训练时间越长，其平均潜伏期就越短。3组大鼠前3d潜伏期都会下降，在此之后潜伏期就会趋于平稳。其中正常组和对照组约需要25s找到平台：而实验组潜伏期比正常组和对照组寻找平台的时间都要长，约需45s找到平台(图15-2)。

(二)空间探索能力

由实验观察可知，正常组和对照组大鼠的游泳轨迹都集中在站台象限，但有所不同，它们分别约占总游泳轨迹的45％和39％，利用SPSS统计分析可得，与其他象限间游泳轨迹有显著性差异(P<0.01)。实验组大鼠在站台象限的游泳轨迹约占总游泳轨迹的28％，其余象限分别为29％(R)、20％(O)和21％(L)，各象限间比较无差异(P>0.05)，结果提示：实验组大鼠的游泳轨迹在4个象限中基本呈随机分布(图15-3)。

六、注意事项

(1)实验前应该了解大鼠的相关信息，例如，切忌手抓大鼠尾巴，以免过度刺激大鼠。

(2)开颅前，应该熟知大鼠的海马伞具体位置，以免开错位置给实验大鼠带来更大损伤。

(3)腹腔注射，例如，麻醉、青霉素注射时，应45°进针后回抽，见空气后方可注射。若出现血性或其他液体(可能是尿液)，则退针重新进行注射。

(4)注射时，注射的量要准确，因为注射过多过少都会影响受试大鼠。

(5)用颅骨钻开颅时，应该控制好力度并观察开颅的位置是否发生了变化，以免造成大鼠第二次损伤或者死亡。

(6)每一只大鼠做完手术后，都要用碘伏给手术刀和相关物品进行消毒，以免下一次用的时候感染其他大鼠。

(7)缝针时，注意确保头颅已经完全缝合，以免头颅组织暴露在空气中，容易感染细菌或流血过多以致死亡。

(8)Morris水迷宫检测时，水池要符合规格，池水要适量，同时要确保实验者离开水池，以免影响大鼠运动。

(9)要保证水迷宫水面上没有光影，以免影响最终自动分析大鼠中心点。解决措施：将屋子里的灯都关掉，窗帘都拉上，切断光源。

(10)Morris水迷宫测试后，要注意给大鼠保温以免大鼠温度过低而死亡。措施：测试后，将大鼠放到烤炉旁保温或者用电吹风将其毛给吹干。