摘要：许多肝病都与肝纤维化有关。 大多数肝纤维化的临床前研究都是在啮齿动物等小动物身上进行的，因此缺乏直接推断人类疾病的直接潜力。 本研究的目的是开发与转化研究更相关的灵长类动物肝纤维化模型。

 

方法：使用CCl4对成年雄性健康恒河猴重复给药（40%橄榄油，1.5ml/kg，通过腹膜注射，皮下注射或胃管灌胃，每3天一次）诱导肝纤维化。 在各个时间点进行肝活检以进行组织学检查。 抽取血样用于标准肝功能测试。

 

结果：胃管灌胃法是建立稳定的肝纤维化，不会因毒性而导致动物死亡的最佳方法。纤维化的进展可能涉及上皮向间质的转变和肝小管反应。结论：恒河猴反复进行CCl4灌胃可导致稳定的肝纤维化。该模型可作为今后研究肝纤维化的有效平台。

 

 

肝纤维化是由感染，药物毒性，代谢紊乱，免疫攻击和其他原因引起的肝损伤反复发作引起的。 其特征是由于细胞外基质沉积在肝细胞外而形成纤维间隔，并涉及多种细胞类型和介质的作用和相互作用。与小型动物相比，非人类的灵长类动物更接近人类，因此在许多领域，特别是在神经科学领域已被广泛使用。在本研究中，我们开发了一种灵长类动物肝纤维化模型。

 

四氯化碳给药途径的筛选：猴皮下注射四氯化碳，五天内出现严重的皮肤溃疡。接受腹腔注射四氯化碳的猴中，有一只在131天后死亡，尸检显示有严重的腹腔粘连、中量的透明腹水、部分肠充血和严重的胃肠道坏死。其余两只接受CCl4腹腔注射的猴在注射后180d仍存活。相比之下，三只接受CCl4灌胃的猴子在180天后均存活。

 

腹腔注射与灌胃治疗后肝纤维化：CCl4给药前肝活检组织结构正常，细胞排列有序，纤维间隔明显。CCl4腹腔注射或胃灌胃给药后60?天，肝细胞内有大小不等的空泡，部分肝细胞细胞核偏离中心，脂肪变化明显。120d时细胞排列紊乱，中央静脉消失，肝小叶消失。严重炎症，窦周间隙纤维化，门区间隔不全。Laennec活检组织纤维化得分为2，表明纤维化。与通过腹膜内注射相比，在通过胃管接受CCl4的动物中，纤维化更为明显。180d时，CCl4灌胃组动物的Laennec评分为4分，CCl4腹腔注射组动物的Laennec评分为3分。与腹膜内注射相比，在通过胃管接受CCl4的动物中，纤维化间隔和假叶的形成更为突出。无论给药途径如何，天狼星红染色均显示纤维化。

 

免疫荧光：免疫荧光研究显示随着时间的推移α-SMA的表达增加。肝星状细胞（Hepatic stellate cells，HSCs）首先出现在肝门区，随着肝纤维化的进展，沿纤维间隔向外扩展。FN所反映的细胞外基质的沉积，主要在Disse间隙，逐渐增多。GS主要在肝小静脉周围的肝细胞中表达； 其表达随肝纤维化进展而下降，在后期明显下降。G6Pase的表达逐渐下降，提示肝细胞损伤和功能下降。 相反，干细胞标志物Nestin的表达增加，表明肝内干细胞数量增加。两组动物之间α-SMA和FN免疫染色的比较显示，与腹膜内注射法相比，通过胃管灌胃法接受CCl4的动物肝脏纤维化更为突出。

 

 

CCl4灌胃法建立肝纤维化模型：胃灌胃后120天，肝组织H＆E染色，Masson染色，天狼星红染色显示出纤维结构。多普勒剪切波弹性成像：彩色多普勒超声显示CCl4给药前肝实质回声均匀。灌胃120?天后，回声不均匀，但未见结节。横波弹性成像显示肝脏硬度增加。血液生化：肝功能检查显示，CCl4给药前肝功能正常：天门冬氨酸转氨酶（AST）35.43±2.47UI / L；丙氨酸转氨酶（ALT）32.97±5.29UI / L；总蛋白（TP）79.90±2.18g/L；ALB，43.17±4.38g / L; 和球蛋白（GLO）为36.73±3.13g/ L。在120天时，AST升高至69.30±10.91 UI / L； ALT增加至63.03±13.15 UI / L； 总磷降至71.70±3.01g/ L; ALB降至33.93±5.10g/ L; GLO略升至37.77±4.78 g / L。

 

 

肝纤维化、肝功能及肝干细胞相关蛋白的Western blotting研究：CCl4灌胃后120天，HSCs标志物α-SMA水平升高。同样，由FN水平反映的细胞外基质的沉积也增加了。促进肝纤维化的IL-6和TGF-β1水平升高，而肝脏代谢GS和ALB的标志物明显降低。 EPCAM和GGT1的水平增加。 干细胞标志物AFP和Nestin的水平增加。

 

mRNAs与肝纤维化、肝功能及肝干细胞的定量RT-PCR研究：荧光定量rt-PCR结果显示，CCl4灌胃后120天，编码肝组织纤维化相关基因α-SMA，基质金属蛋白酶-9（MMP-9），MMP-2，组织金属蛋白酶抑制剂-2（TIMP -2）和TIMP-1的mRNA水平升高。相反，编码肝功能相关基因GS，ALB和G6Pase的mRNA水平下降。 与上皮-间质转化（EMT）相关的基因plagoglobin和E-cadherin基因被下调，而Snail被上调。肝导管反应性基因Epcam和Cytokeratin19（CK19）上调，干细胞标记基因SOX9和nestin上调.

 

综上所述，在适当剂量（40%，每3天1次，1.5ml/kg）下，CCl4灌胃可有效诱导恒河猴稳定肝纤维化。纤维化的进展可能与EMT和肝管反应有关。该模型为今后研究肝纤维化提供了有价值的工具。