灵长类动物肝纤维化模型的建立与验证
2019年12月11日
来源:Journal of Pharmacological and Toxicological Methods Volume 100, November–December 2019, 106600
作者:李晓菲译
责任编辑:admin
摘要:许多肝病都与肝纤维化有关。 大多数肝纤维化的临床前研究都是在啮齿动物等小动物身上进行的,因此缺乏直接推断人类疾病的直接潜力。 本研究的目的是开发与转化研究更相关的灵长类动物肝纤维化模型。
摘要:许多肝病都与肝纤维化有关。 大多数肝纤维化的临床前研究都是在啮齿动物等小动物身上进行的,因此缺乏直接推断人类疾病的直接潜力。 本研究的目的是开发与转化研究更相关的灵长类动物肝纤维化模型。
方法:使用CCl4对成年雄性健康恒河猴重复给药(40%橄榄油,1.5ml/kg,通过腹膜注射,皮下注射或胃管灌胃,每3天一次)诱导肝纤维化。 在各个时间点进行肝活检以进行组织学检查。 抽取血样用于标准肝功能测试。
结果:胃管灌胃法是建立稳定的肝纤维化,不会因毒性而导致动物死亡的最佳方法。纤维化的进展可能涉及上皮向间质的转变和肝小管反应。结论:恒河猴反复进行CCl4灌胃可导致稳定的肝纤维化。该模型可作为今后研究肝纤维化的有效平台。
关键词:四氯化碳 恒河猴 肝纤维化
肝纤维化是由感染,药物毒性,代谢紊乱,免疫攻击和其他原因引起的肝损伤反复发作引起的。 其特征是由于细胞外基质沉积在肝细胞外而形成纤维间隔,并涉及多种细胞类型和介质的作用和相互作用。与小型动物相比,非人类的灵长类动物更接近人类,因此在许多领域,特别是在神经科学领域已被广泛使用。在本研究中,我们开发了一种灵长类动物肝纤维化模型。
四氯化碳给药途径的筛选:猴皮下注射四氯化碳,五天内出现严重的皮肤溃疡。接受腹腔注射四氯化碳的猴中,有一只在131天后死亡,尸检显示有严重的腹腔粘连、中量的透明腹水、部分肠充血和严重的胃肠道坏死。其余两只接受CCl4腹腔注射的猴在注射后180d仍存活。相比之下,三只接受CCl4灌胃的猴子在180天后均存活。
腹腔注射与灌胃治疗后肝纤维化:CCl4给药前肝活检组织结构正常,细胞排列有序,纤维间隔明显。CCl4腹腔注射或胃灌胃给药后60?天,肝细胞内有大小不等的空泡,部分肝细胞细胞核偏离中心,脂肪变化明显。120d时细胞排列紊乱,中央静脉消失,肝小叶消失。严重炎症,窦周间隙纤维化,门区间隔不全。Laennec活检组织纤维化得分为2,表明纤维化。与通过腹膜内注射相比,在通过胃管接受CCl4的动物中,纤维化更为明显。180d时,CCl4灌胃组动物的Laennec评分为4分,CCl4腹腔注射组动物的Laennec评分为3分。与腹膜内注射相比,在通过胃管接受CCl4的动物中,纤维化间隔和假叶的形成更为突出。无论给药途径如何,天狼星红染色均显示纤维化。
免疫荧光:免疫荧光研究显示随着时间的推移α-SMA的表达增加。肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSCs)首先出现在肝门区,随着肝纤维化的进展,沿纤维间隔向外扩展。FN所反映的细胞外基质的沉积,主要在Disse间隙,逐渐增多。GS主要在肝小静脉周围的肝细胞中表达; 其表达随肝纤维化进展而下降,在后期明显下降。G6Pase的表达逐渐下降,提示肝细胞损伤和功能下降。 相反,干细胞标志物Nestin的表达增加,表明肝内干细胞数量增加。两组动物之间α-SMA和FN免疫染色的比较显示,与腹膜内注射法相比,通过胃管灌胃法接受CCl4的动物肝脏纤维化更为突出。
CCl4灌胃法建立肝纤维化模型:胃灌胃后120天,肝组织H&E染色,Masson染色,天狼星红染色显示出纤维结构。多普勒剪切波弹性成像:彩色多普勒超声显示CCl4给药前肝实质回声均匀。灌胃120?天后,回声不均匀,但未见结节。横波弹性成像显示肝脏硬度增加。血液生化:肝功能检查显示,CCl4给药前肝功能正常:天门冬氨酸转氨酶(AST)35.43±2.47UI / L;丙氨酸转氨酶(ALT)32.97±5.29UI / L;总蛋白(TP)79.90±2.18g/L;ALB,43.17±4.38g / L; 和球蛋白(GLO)为36.73±3.13g/ L。在120天时,AST升高至69.30±10.91 UI / L; ALT增加至63.03±13.15 UI / L; 总磷降至71.70±3.01g/ L; ALB降至33.93±5.10g/ L; GLO略升至37.77±4.78 g / L。
肝纤维化、肝功能及肝干细胞相关蛋白的Western blotting研究:CCl4灌胃后120天,HSCs标志物α-SMA水平升高。同样,由FN水平反映的细胞外基质的沉积也增加了。促进肝纤维化的IL-6和TGF-β1水平升高,而肝脏代谢GS和ALB的标志物明显降低。 EPCAM和GGT1的水平增加。 干细胞标志物AFP和Nestin的水平增加。
mRNAs与肝纤维化、肝功能及肝干细胞的定量RT-PCR研究:荧光定量rt-PCR结果显示,CCl4灌胃后120天,编码肝组织纤维化相关基因α-SMA,基质金属蛋白酶-9(MMP-9),MMP-2,组织金属蛋白酶抑制剂-2(TIMP -2)和TIMP-1的mRNA水平升高。相反,编码肝功能相关基因GS,ALB和G6Pase的mRNA水平下降。 与上皮-间质转化(EMT)相关的基因plagoglobin和E-cadherin基因被下调,而Snail被上调。肝导管反应性基因Epcam和Cytokeratin19(CK19)上调,干细胞标记基因SOX9和nestin上调.
综上所述,在适当剂量(40%,每3天1次,1.5ml/kg)下,CCl4灌胃可有效诱导恒河猴稳定肝纤维化。纤维化的进展可能与EMT和肝管反应有关。该模型为今后研究肝纤维化提供了有价值的工具。
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