慢性酒精中毒(alcoholism)、酒精依赖是全世界普遍关注的一个重要社会问题。我国对慢性酒精中毒这一概念着重强调的是由于长期过度饮酒所致的器质性精神障碍。长期、反复酗酒，以致躯体和精神两方面都发生明显改变，导致社交功能、职业功能和社会适应能力受到严重损害。酒精(alcohol, ethanol)是一种最常见也是人类历史上使用时间最长的成瘾药物。适度饮酒对于大多数人是无害的，但过度饮酒甚至滥用酒精的后果非常严重，甚至可能危及生命。大量饮酒可能增加某些肿瘤的患病风险，也可引起免疫功能下降、中枢神经系统损害。怀孕期间饮酒可影响胎儿的发育，引起胎儿酒精综合征(fetal alcohol syndrome,  FAS)和胎儿酒精谱系障碍(fetal alcohol spectrum disorder, FASD)，表现如初生儿低体重、低智能、生长发育严重损害，还可产生人格改变等。在酒精成瘾的研究中，动物模型的建立是必不可少的，笔者实验室对酒精中毒的动物模型在前人的基础上进行了改良，建立了自己的慢性酒精中毒小鼠模型。

一、实验动物的选择及分组

实验动物：雄性C57BL/6J小鼠60只，6～8周龄，实验前体重22～27g。实验过程中动物饲养在昆明医科大学神经科学研究所动物房，温度(20±3)℃，湿度(50±10)％，给予无限制饮食。所用动物在用于实验之前至少在动物房饲养1周以适应新的环境。本研究中所用的食用酒精达到GB 10343-2008普通级水平，原浓度≥95％。

二、造模方法

慢性酒精中毒组：将60只小鼠饲养在一间安静房间的笼子里。3～5只小鼠饲养为一笼，饲养环境为昼夜各12h，温度为(22±1)℃，湿度为(52±2)％。以酒精和水的体积比为5％(WV)的初始浓度进行灌胃，按10ml/kg量取酒精溶液。第2周、第3周酒精浓度分别为10％(V/V)、20％(V/V)，自第4周起维持35％(WV)的浓度至第8周末。并将酒精溶液作为唯一的饮水来源。至8周末。灌胃结束时再将酒精中毒组小鼠随机分为慢性酒精中毒组、酒精戒断1天组、酒精戒断3天组和实验因子干预组。

正常对照组：另10只小鼠不灌白酒，灌服与白酒同体积的生理盐水作为正常对照组。各组动物饲养环境、条件均相同：分笼普通饲养，自由饮水摄食。间隔一周，模型组及对照组小鼠称体重一次，并记录其体重变化。慢性灌酒组小鼠灌酒期间常规观察大鼠兴奋性、活动情况、刺激反应性等行为学变化，以及体重变化、毛发色泽改变及精神状态等一般情况。

三、小鼠慢性酒精中毒模型的行为学测试评价

(一)Morris水迷宫(MWM)

    应用Morris水迷宫测试小鼠的空间学习、记忆情况。实验装置：Morris水迷宫主体为不锈钢圆形水池，迷宫上方安置着连接显示系统的摄像机，同步记录小鼠的运动轨迹(图18-2)。

(1)第1天为小鼠对水迷宫的适应期：将小鼠从目标象限面向池壁放入水中，让其自行游泳5min，用干毛巾擦干后送回笼中，记录其游泳的速度，为其基线。

(2)可见平台实验：第2天上午进行可见平台实验，使平台露出水面1cm，观察小鼠从某一固定点入水至爬上平台的时间，训练一个时段(4次)。超过60s找不到平台，可引导其找到平台。

(3)定位航行实验：将平台隐入水下1cm，再将小鼠面向并靠近池壁随机从4个不同象限入水，软件系统将记录下小鼠入水到爬上平台的游泳时间，此为逃避潜伏期。超过60s找不到平台，可引导其找到平台。每天训练一个时段(4次)，连续4d。

(4)空间探索实验：第7天上午进行空间探索实验。测量60s内：①动物在目标象限(原平台所在象限)和其他各象限的游泳时间；②游泳速度；③穿越目标(原平台位置)次数。

(二)旷场实验

旷场实验(OFZ)又称敞箱实验，是评价实验动物在新奇环境中自主行为、探究行为与紧张度的一种方法。以实验动物在新奇环境之中某些行为的发生频率和持续时间等反映实验动物在陌生环境中的自主行为与探究行为。本实验的场地为一正方形敞口箱(长×宽×高＝40cm×40cm×35cm)，底部等分25格。将饮酒7d、14d、21d、28d、56d及对照组小鼠逐只放入开场中，观察10min，记录后5min内：①动物爬格数(以动物1/3以上的身体超过线而在不同的格子内为过线)，爬过一格得1分；②动物站立次数(以动物双前腿举起，质量全在后腿上为站立)，站立一次为1分；③动物理毛次数。

(三)小鼠强迫游泳实验(FST)

抑郁是酒精戒断综合征的早期症状之一。动物被迫在一个局限的空间中游泳，首先出现游泳、攀爬、挣扎试图逃脱，随后即进入一种被称为“行为绝望”的不动状态，以反映动物的抑郁状态。实验时，将对照组，饮酒组，酒精戒断24h、48h、72h小鼠逐只放入高45cm、直径20cm、水深20cm的游泳水槽中[水温维持在(22±1)℃]，观察6min，记录后4min内小鼠的绝对不动时间。

(四)酒精催眠效果检测

本研究使用翻正反射的模型来检测酒精的催眠效果，给小鼠腹腔注射催眠剂量的酒精(3.5g/kg)，然后将其仰面放在一个V形凹槽中，连续1次1min以内成功翻正即计为翻正反射已恢复，记录其恢复翻正反射的时间。在注射抗体或者正常的IgG 12h后，重复此测试。正常情况下，第2次恢复翻正反射的时间比第1次要短，即酒精催眠效果的耐受，本研究中也观察到了此现象。将翻正反射的恢复时间作为衡量酒精催眠效果的指标。

(五)酒精喜爱性检测

该方法的执行程序参考Sanchis-Segura等发表的评估酒精相关行为的讨论，在室温(20±3)℃、湿度45％～55％的环境中，将动物单笼单只饲养，同时给予一瓶自来水和一瓶10％酒精溶液，记录自来水和酒精溶液的消耗量(称重)。第2天提供同样的液体，只是将酒精和自来水的瓶子调换位置。为了避免液体的渗漏和蒸发造成的误差，同时放5～8ml液体于空笼上记录液体的渗漏和蒸发，动物的消耗量＝总的消耗量－渗漏和蒸发量。衡量酒精喜爱性有两个指标：一个是酒精消耗量占总液量的百分比，一个是酒精消耗的绝对量[单位为g/(kg·d)]。

四、讨论

在灌胃过程中，有6只小鼠死于灌胃损伤，4只死于极度消瘦，最后完成实验小鼠：对照组10只。慢性酒精中毒组40只。对照组小鼠无一死亡。连续白酒灌胃56d后，模型组小鼠毛发无光泽，性情不稳定，鼻尖湿红，轻者烦躁不安、精神委靡、反应淡漠、食欲减退和行动迟缓，重者体态呆板、睡眠时间明显增多、活动明显减少、进食量少于正常对照组、体重增长缓慢，证明慢性酒精中毒模型成功建立。正常对照组小鼠毛发有光泽，体态活泼，食量及大便正常，无嗜睡现象。

灌胃是比较接近人类摄入酒精的方式，剂量和浓度可以较大范围地调整，缺点是容易对动物口腔和胃黏膜造成损伤。本实验参考国内外相关文献，采用改良的灌胃方式建立慢性酒精中毒的模型。在本研究中，总的灌胃时程为8周，以酒精和水的体积比为5％(V/V)的初始浓度进行灌胃，第2周、第3周酒精浓度分别为10％(V/V)、20％(V/V)，自第4周起维持35％(V/V)的浓度，至第8周末。8周的灌胃时间内，只有3只小鼠因为操作者灌胃技术不熟练而窒息死亡。采用酒精浓度递增的方法可以增加小鼠对酒精的适应性和模型的稳定性。同时8周的时间限制，可以排除小鼠因为老龄化而造成的学习、记忆功能下降。

(一)小鼠体重的改变

慢性灌酒期间第1～2周，小鼠的体重减轻较明显，其可能是因为才开始酒精溶液灌胃，小鼠对酒精不适应，所以体重减轻较明显。第3～4周，小鼠对低浓度酒精溶液开始适应，产生了耐受，且这时的酒精浓度不太高，对小鼠的进食影响不明显，所以小鼠体重又开始回升。至第5周时。小鼠体重又开始下降，可能是酒精溶液的浓度增加至35％，且一直维持这个浓度，小鼠因长期进食量减少，营养缺乏，故而体重又开始下降。

(二)Morris水迷宫实验

Morris水迷宫是检测小鼠海马依赖的空间位置学习、记忆能力最常用的工具。慢性酒精溶液灌胃后，慢性酒精中毒组小鼠的学习能力和空间探索、记忆能力明显低于正常对照组小鼠，即慢性酒精灌胃的模型导致了小鼠认知功能受损。

(三)慢性酒精中毒戒断后小鼠的抑郁行为

抑郁是经常伴随出现的情绪活动，亦是酒精戒断常见的早期症状之一。本研究采用小鼠强迫游泳实验(FST)，观察了慢性酒精中毒小鼠进行酒精戒断后的抑郁症状。结果与 Pandev等(1999)报道的大鼠酒精戒断后24～72h具有显著的焦虑情绪基本一致。提示慢性酒精中毒小鼠模型的建立是成功的，在戒断的早期确实会出现酒精戒断的抑郁症状，且该症状会随着戒断时间的延长而逐渐消退。

(四)水平动机活动(OFT)

慢性饮酒可导致水平动机活动(horizontal locomotor activity，爬格数)显著减少，与水平动机活动变化相平行的是探究行为(exploratory behavior，站立次数)、理毛次数(grooming)等。这些均与对照组有明显的差异，提示建模成功。