一、实验目的

(1)熟悉建立吗啡依赖大鼠模型的方法，复制吗啡依赖大鼠模型。

(2)观察吗啡依赖大鼠的戒断症状并评分，判断吗啡依赖大鼠模型成功建立与否。

二、实验材料与方法

(一)实验材料

1.所需设备

(1)带盖玻璃标本缸(高度不小于45cm，直径30cm)：用于观察大鼠的戒断症状。

(2)普通电子天平称量大鼠体重。

(3)大鼠饲养笼具及相关设施(含饮水、喂食、垫料)等。

2.所需试剂

(1)盐酸吗啡注射液：规格1ml为10mg×10支/盒，批号为国药准字H21022436。常温保存。

(2)盐酸吗啡注射液作为毒麻药品，严格遵循学校关于毒麻药品试剂管理的相关规章制度，包括事先的使用计划审批、采购，日常管理中双锁双人保险柜管理，使用时领用登记等。

(3)0.9％氯化钠注射液：500ml/瓶，批号为国药准字H20056626。常温保存。

(4)盐酸纳洛酮注射液：规格0.4mg为1ml×5支/盒，批号为国药准字H20055758。常温保存。

3.试剂配制  无特殊试剂配制要求。

(二)实验具体方法和操作步骤

1.实验动物  健康SD大鼠40只，体重(260±20)g，雌雄各半，由昆明医科大学实验动物学部实验动物中心提供。按随机分组原则，分为空白对照组和吗啡依赖组，吗啡依赖组又分为吗啡依赖1周组、吗啡依赖2周组、吗啡依赖4周组、吗啡依赖8周组4个亚组。即实验大鼠共分5组，每组8只，分笼喂养，自由摄食、饮水。观察并记录其活动、摄食量、饮水量、大便等情况。

2.实验方法  吗啡依赖组大鼠按逐日递增原则，背部皮下注射盐酸吗啡注射液，每天注射3次(8：00、12：00、16：00)，连续注射5d。每次注射剂量依次为：第1天5mg/kg、第2天10mg/kg、第3天20mg/kg、第4天40mg/kg、第5天50mg/kg。每次注射前严格消毒，用一次性注射器注射，每天称动物体重一次。空白对照组注射相同剂量的生理盐水。4组吗啡依赖大鼠于第6天每组随机选取2只于吗啡注射前2h皮下注射盐酸纳洛酮注射液5mg/kg进行催促实验诱发戒断症状，放在玻璃标本缸中观察戒断症状并给予评分，空白对照组给予同样处理并给予评分。

确认吗啡依赖后，吗啡依赖1周组、吗啡依赖2周组、吗啡依赖4周组、吗啡依赖8周组分别给予30mg/kg盐酸吗啡背部皮下注射，每天一次，连续注射1周、2周、4周、8周，建立4个不同时段的吗啡依赖大鼠模型(表18-4)。

不可数症状包括上睑下垂、流涎、腹泻。观察时每2min评定1次上睑下垂；其他不可数症状则按严重程度进行评分：无症状评为0分，轻度1分，严重2分。各症状分别相加得戒断症状总分，凡接触时有惊叫的大鼠均再增加2分，全部症状得分之和为戒断总分。

(三)实验操作中各步注意事项

(1)在大鼠注射吗啡实验第一阶段的5d中，可能发生死亡的情况，尤其是第3天(将注射剂量从10mg/kg提高到20mg/kg)和第4天(将注射剂量从20mg/kg提高到40mg/kg)。由于剂量变化大，部分动物可能出现药物不耐受而死亡，需密切观察，降低动物的死亡率。

(2)在注射时注意无菌操作。大鼠背部皮肤注射前将毛发剪短，暴露皮肤，采用75％医用酒精进行皮肤消毒，使用1ml一次性注射器注射，每只大鼠一支注射器，避免交叉污染。

(3)每次使用玻璃缸进行戒断症状观察后，需用75％医用酒精仔细擦拭干净，再放入另一只动物进行观察。目的是清洁并且消除气味，避免先前实验大鼠对后续实验大鼠的干扰。

三、实验结果

对两组大鼠的戒断症状进行观察、记录。吗啡依赖组大鼠各种可数戒断症状表现显著，且发生次数明显多于对照组，经过t检验，组间比较具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)，证明已成功建立吗啡依赖大鼠模型。观察的戒断症状包括：可数症状(湿狗样颤抖、伸展、清理皮毛、吞咽、站立、跳跃、齿颤)和不可数症状(上睑下垂、流涎、腹泻)等。参照 Maldonade等的方法和评分标准进行评分，记录可数症状在观察时间内发生的次数，按戒断症状评分标准进行评分(表18-5)。

四、结果分析

通过采用逐日剂量递增、背部皮下注射盐酸吗啡注射液，使用盐酸纳洛酮注射诱发戒断症状，然后对戒断症状进行评分，并进行对照组和依赖组比较的方法，成功建立了吗啡依赖大鼠模型。

本方法具有操作简便、动物死亡率低、观察戒断症状直观、评分标准可操作性强等优点，是较好的建立吗啡依赖大鼠模型的方法。

五、经验与体会

(1)根据实验大鼠可数戒断症状和不可数戒断症的观察，以及评分结果的比较，本实验成功建立了吗啡依赖大鼠模型。

(2)在实验过程中有两个需要特别注意的问题：一是前述提及的实验第3天、第4天注射剂量变化较大，需密切注意观察，降低动物的死亡率；二是注意戒断症状的评分由经过培训的非本课题组的人员进行。以避免主观因素的干扰。