摘要：在过去的十年中，我们对小儿癫痫的遗传病因学的了解已大大增加。 然而，为了将改进的诊断方法转化为个性化治疗，迫切需要将癫痫的分子病理生理学与癫痫发作的全脑动力学联系起来。斑马鱼已经成为癫痫发作疾病的一种有前途的新动物模型，尤其与遗传和发育性癫痫有关。作为用于癫痫研究的新型模型生物，它们具有以下关键优势：斑马鱼幼体体积小，可以进行高通量的体内实验。先进的遗传工具的可用性允许有针对性地修改脊椎动物系统中的特定人类遗传疾病（包括遗传性癫痫）模型；通过光学方式进入整个中枢神经系统，为先进的显微镜技术在完整的幼虫斑马鱼脑中的图像结构和功能提供了基础。越来越多的文献描述和表征幼虫斑马鱼的癫痫发作和癫痫特征。 最近，遗传编码的钙指示剂已用于通过光学显微镜研究这些癫痫发作的神经生物学基础。这种方法为了解癫痫发作的多尺度动力学提供了一个独特的窗口，可同时捕获全脑动力学和单细胞行为。将斑马鱼幼鱼脑内钙离子成像的观察结果与对癫痫发作的理解联系起来是非常重要的，癫痫发作主要来源于人类患者和哺乳动物动物模型的皮层电生理记录。

 

在这篇综述中，我们简要说明了斑马鱼癫痫研究的最新状况，特别着重于幼虫斑马鱼癫痫发作的钙成像。我们举例说明了癫痫大脑动态系统视角的实用性，它提供了一种原则性的方法来链接跨物种的观察结果，并确定与癫痫病最相关的大脑动力学特征。在以下部分中，我们将对与癫痫和癫痫发作相关的影像学特征进行调查，并将这些影像学与人类和其他更传统的动物模型的观察结果联系起来。最后，我们确定了斑马鱼幼体癫痫研究仍然面临的主要挑战，并指出了未来研究的策略，以解决这些问题，并更直接地与在其他模型系统和人类患者中研究癫痫产生的主题和问题相结合。

 

 

简介：基因组诊断彻底改变了我们对小儿癫痫病因的认识-我们现在可以在大多数特定患者中鉴定出基因突变。这对精确靶向治疗的未来有着很好的影响。但是，为了有效地将这些见解转化为新的治疗方法，迫切需要更好地了解癫痫病的分子原因与全脑动力学之间的关系。目前尚不清楚受癫痫相关基因突变影响的多种生物学途径中的功能障碍如何融合模式化的癫痫临床表型。斑马鱼可能有助于弥合分子遗传学，理论模型和临床癫痫研究中观察到的差异。在过去的十年中，斑马鱼已经成为研究早期模式和发育的主要脊椎动物模型。斑马鱼具有复杂但易于访问的中枢神经系统，在研究从自闭症到癫痫病的许多人类神经发育障碍的病理生理学中发挥了关键作用。 斑马鱼基因组虽然经历了整个基因组的复制，但与人类基因组高度同源，保留了80％以上的致病基因，并且在遗传上也易于处理。CRISPR / cas9等基因组编辑技术可实现与人类癫痫相关的基因的靶向突变，结合转座子介导的整合，现在可有效生成稳定的斑马鱼转基因品系，潜在地涵盖与癫痫有关的广泛基因。

 

斑马鱼已经在药物发现中发挥了关键作用。幼虫癫痫斑马鱼已用于“高通量”实验中，结合了简单的行为运动读数和电生理学方法，从而鉴定出了几种Dravet综合征的先导化合物。斑马鱼癫痫模型以自发性发作为特征，在临床相关性和药理学可预测性方面可能比哺乳动物模型更可靠。鱼的体外受精使胚胎适合于观察发育早期的病理过程。受精后一周，斑马鱼的大脑仅包含约100,000个神经元（约占人类大脑的百万分之一），体积小于1 mm3，但仍显示出典型的脊椎动物大脑解剖结构，在大脑各区域与哺乳动物的对应区域具有高度的功能同源性。胚胎的透明性允许使用光学显微镜工具直接观察中枢神经系统的发育。随着显微镜技术的最新发展，这种技术现在可以在几乎全脑覆盖和单细胞分辨率下实现。此外，荧光转基因钙报告基因（例如GCaMP和RGECO）现在可以促进行为或静止时单个神经元功能的实时成像。因此，神经元功能的光学记录可实现空前的空间分辨率（与局部场电势或脑电图记录相比），并且覆盖率仍然很高（与单细胞电生理记录相比）-是研究癫痫动力学的理想选择，其中两个异常单 细胞行为和种群动态已被描述。综合考虑-遗传可处理性，较小的幼体大小和显微镜工具的可用性-斑马鱼提供了一个独特的机会来研究具有遗传原因（包括一系列癫痫病）的发育障碍的全脑动态背后的神经回路。然而，我们目前对癫痫和癫痫发作的大多数理解来自哺乳动物大脑中的电生理记录。 因此，评估幼虫斑马鱼大脑钙成像中癫痫动态的潜在特征，并将新的见解与对癫痫动态的现有理解相结合将提出新的挑战。本文将向读者介绍斑马鱼癫痫的研究现状。我们将回顾癫痫动力学的一些关键原理，以及它们如何在癫痫脑的钙成像中表现出来。

 

斑马鱼急性癫痫模型的建立：自Baraban等人于2005年首次发表以来，对斑马鱼癫痫发作模型的兴趣已大大增加。这项开创性的研究建立了监测暴露于常见惊厥剂戊四氮（PTZ）的斑马鱼幼鱼癫痫发作行为和脑电图方法。。 在斑马鱼诱发癫痫发作期间成年斑马鱼的多通道脑电图记录已显示出与人类脑电图记录的定性同源性，其发作频率（2–7 Hz）与患者的头皮脑电图大致相当。然而，斑马鱼中的EEG和LFP记录均未能证明存在人和啮齿动物的微电极阵列记录显示出高伽马振荡（80–150赫兹）。斑马鱼大脑中静止状态下的持续活动与哺乳动物的活动完全不同，特别是在幼体大脑中，活动是不连续的，以孤立的活动爆发为特征。鉴于这些差异，重要的是要注意到癫痫发作的电图特征可能在不同物种之间是不同的，并且随着鱼类癫痫新基因模型的出现，需要进一步详细的特征描述。随后的研究表明，惊厥药对幼虫和成年斑马鱼的癫痫样发作活动的稳健性。

在行为水平上，暴露于PTZ或海藻酸会导致游泳活动的普遍增加，在较高的药物浓度下，未经处理的野生斑马鱼很少观察到全身抽搐运动。在琼脂糖固定化幼虫前脑或中脑的电生理记录中，可以清楚地观察到这些急性药物操作甚至高温下反复出现的短暂发作间期样放电和长时间多峰发作性样放电。斑马鱼幼鱼PTZ诱发的癫痫发作对苯二氮卓类和丙戊酸钠等抗癫痫药物敏感，与长期以来治疗啮齿动物PTZ诱发癫痫的有效性相匹配。这样，斑马鱼模型可以概括行为和电生理特征，以及哺乳动物大脑中急性癫痫发作对AED的反应。尽管这些急性癫痫模型带来了新的见解（在下面更详细地描述），但它们并没有捕捉到癫痫的几个关键特征，如自发发生的癫痫、神经发育性共病和发作间大脑动力学的某些特征。然而，我们越来越多地可以确定许多癫痫患者的潜在遗传病因，特别是在儿科癫痫。这些已知的遗传机制现在为斑马鱼癫痫模型的建立提供了机会。特别是针对lgi1，kcnq3，chd2，kcnj10a，stx1b和scn1lab的斑马鱼模型。

 

Baraban实验室最初基于随机ENU（N-乙基-N-亚硝基脲）突变筛选描述了更稳定、或许更令人信服的遗传模型：mib/ube3A和scn1lab。有趣的是，scn1lab552-/-幼虫表现出自发的异常电图活动，运动亢进和抽搐活动，起始于3 dpf并持续到10-12 dpf左右的早期死亡。Dravet综合征的这种模型已在行为，电生理，转录组和代谢水平进行了表征，并已广泛用于药物筛选。最近，诸如CRISPR / Cas9之类的新型靶向诱变技术的出现为针对所有可能的人类癫痫单基因突变的稳定遗传模型的产生打开了大门。

 

大脑癫痫的动态特征：从在人类癫痫患者中使用头皮电生理学进行诊断的一个世纪的经验中，一系列的特征已经成为癫痫患者大脑的主要脑电图特征：这些包括癫痫发作之间或期间的特定“癫痫样”放电（例如尖峰和波状放电），癫痫发作期间节律性EEG活动的形状和组成的特征性变化，通常通过专家的视觉分析（例如癫痫发作的节奏）来识别 癫痫发作时），以及可通过计算工具测量的脑电信号成分中一些更细微的定量差异（例如，锁相高伽马活性的增加，低阿尔法功率的增加或阿尔法相位同步性的降低）。由于这些记录方式在空间和时间尺度上存在差异，因此识别可能与癫痫性脑电图标记相对应的可能的钙影像学测量并非易事：用遗传编码的钙指示剂成像的神经元活动具有比电生理记录低得多的时间分辨率，但可以根据时空激发特性分离单个细胞的信号。动态系统的数学描述可以为解释在不同记录方式下观察到的神经元动力学现象和特征提供一个概念性的桥梁。在动态系统的框架内，时变现象（如脑电记录中的神经元放电或振荡）可以用耦合微分方程来描述，该方程能及时捕捉系统状态的演化。此类描述经常用于解释跨多个尺度的神经元系统的动力学-从亚细胞神经元区室的描述到全脑动力学。即使单个零件的行为具有微弱的非线性，也会在耦合系统中出现复杂的动力学，包括由基本模型参数的微小变化驱动的稳定状态之间的过渡。癫痫脑的主要特征，即癫痫发作的倾向，可以被一个在不同振荡机制之间分支的动力学系统优雅地捕捉到，目前已有大量文献报道。这些不同的分支，反过来，可以在一个简单的神经元振荡器模型中再现，其随时间的演化类似于局部场电位和癫痫发作的脑电图记录。像这样基于模型的描述，有助于将一组经验性观察与可能的癫痫相关癫痫发作机制联系起来。这些不仅可以用来描述癫痫发作期间的大脑动力学，还可以描述癫痫发作之间观察到的异常动力学（即发作间期异常）以及可能与癫痫发作活动倾向增加有关的动态状态的定量标记。

当图像在足够高的采样频率下采集时，许多由脑电数据得到的见解和模型也适用于斑马鱼幼虫的钙成像。尽管需要考虑缓慢的探头衰减时间或探针对钙动力学的干扰，但钙成像测量与电生理学的相关性通常很好。然而，当将这些类型的建模策略应用于以较慢采样频率采集的数据时（例如，对于全体积记录），仍然存在挑战。 然而，将单细胞动力学整合到任何模型中的挑战不仅在技术上（即分析代表单个神经元的数千个时间序列），而且在概念上也面临挑战：癫痫动力学来自整个耦合系统的整合行为 。虽然癫痫发作与单个细胞行为的改变有关，但中尺度的动力学变化是癫痫发作活动的诊断标志。这些中尺度动力学不能仅仅从孤立的单细胞行为的观测中准确预测，因此通常被认为是突发性的。

 

斑马鱼大脑中的神经元功能异常成像：目前，在斑马鱼幼鱼的钙成像数据中，可以检查癫痫脑中报告的各种多尺度动力学特征。在这里，我们讨论了斑马鱼大脑中与癫痫发作相关的钙成像的关键特征，并描述了如何利用这些特征来理解癫痫的病理生物学。许多研究已经使用影像学方法来描述GABA-A受体拮抗剂戊四氮（PTZ）如何诱导斑马鱼幼体的急性癫痫发作。这些研究报告了各种动力学特征，揭示了癫痫发生的机制，我们将在下面总结。

 

状态转变：癫痫性癫痫发作的一个关键特征是出现了从正常状态到异常状态的转变，这通常与异常的神经元活动以及跨神经元网络的异常同步有关。斑马鱼PTZ诱发癫痫的影像学表现为大脑状态的改变，其特征是神经元同步性的异常水平，遵循一个特征性的时间过程。在所有的研究中，这些向异常状态的转变的特征是长程功能连接的增加，这意味着失去了通常偏向于邻近神经元和区域连接的空间限制。通过检查细胞活动的低维表示中的时变变化，或根据主成分或相关的低维数据投影的时变功能连接性，提供了一种简洁的方法来表示这种全脑状态转换。此类方法表明，PTZ暴露后会进入异常状态空间，提示癫痫发作过渡。尽管这使得计算上识别全脑过渡成为可能，但此类方法本身并不提供过渡的机械解释。

斑马鱼幼鱼的一个关键和独特的特性是，单神经元分辨率的全脑成像可以用来研究单个神经元和局部网络水平的微尺度变化如何导致宏观尺度的癫痫发作。PTZ给药后癫痫样状态转变的特点是神经同步性的突然增强，这可以在单个神经元和大脑区域之间记录到。这样，钙成像可以将癫痫发作期间的单个神经元活动模式和整个大脑的动力学状态联系起来。 因此，要了解癫痫发作状态转变的细胞机制，就需要了解特定细胞亚群的贡献。这一挑战可以通过双转基因斑马鱼幼鱼来解决，它们在大脑中表达荧光、基因编码的神经活动报告，并在特定的细胞亚群（如兴奋性或抑制性神经元或神经胶质细胞）中使用不同的荧光标记。事实上，利用这些方法的初步证据表明，神经胶质细胞相互作用可能参与了斑马鱼幼鱼向全身性癫痫发作的转变。此外，随着细胞特异性荧光报告剂的出现，人们可以梳理兴奋性和抑制性耦合活性在推动癫痫发作转变中的作用，特别是在遗传性癫痫中，抑制性群体的差异性损伤已经被提出。

 

原文出自：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1090379820300076