来自澳大利亚墨尔本Peter Doherty感染和免疫研究所的一组科学家在线发表了首个针对新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的直接RNA测序研究，使用纳米孔技术对天然RNA分子进行测序，为该新兴病原体的亚基因组mRNA和碱基修饰提供更多见解。该文章于3月8日发表在生物预印网站bioRxiv。

doi:https://doi.org/10.1101/2020.03.05.976167

作者在文章中描述到，冠状病毒的复制过程中会通过一种在合成负链RNA 时独特的“不连续转录”（discontinuous transcription）机制产生不同长度的亚基因组mRNA转录本。不连续的拷贝-选择RNA重组机制可调节冠状病毒基因的表达。而传统的标准RNA病毒测序技术由于生成的读长短，且依赖扩增产生互补DNA（cDNA）序列，无法产生能够代表RNA病毒基因组或亚基因组长度的mRNA序列。

为了定义冠状病毒亚基因组长度mRNA的体系结构，作者使用纳米孔直接RNA测序的方法，从SARS-CoV-2培养样本中制备核酸，并使用R9.4版测序芯片在台式测序仪GridION上进行了测序。

直接RNA序列数据中捕获的SARS-CoV-2特点包括亚基因组mRNA以及RNA碱基修饰。在SARS-CoV-2病毒中, 作者观察到了8个主要的病毒亚基因组mRNA(如下图所示)。直接RNA测序数据还可用于识别一系列病毒中存在的碱基修饰，这些修饰可能在SARS-CoV-2具有功能性的作用，影响宿主-病原体相互作用和病毒复制。作者表示，他们SARS-CoV-2直接RNA测序数据提供的覆盖度足以进行特定的修饰识别。通过对信号空间数据的分析，研究人员确定了42个位置具有预测的5-甲基胞嘧啶修饰，这些修饰出现的位置与亚基因组长度mRNA的位置一致。

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doi: https://doi.org/10.1101/2020.03.05.976167

纳米孔技术能够灵活应对在全长转录本识别、异构体表达和定量、以及病毒检测中的挑战，并具有以下优势：

获取和分析全长转录本：纳米孔设备所提供的长读长范围介于1-100skb， 使得全长转录本的识别和转录组从头（Denovo）组装更容易；

准确识别各基因的多个同源异构体；

识别和量化问题异构体；

RNA直接测序——无偏倚，全长转录本，以及碱基修饰分析；

快速识别和鉴定RNA病毒