摘要：2019年新型冠状病毒（2019-nCoV）的出现引起了全球关注，并且可能是由于现有冠状病毒之间的RNA重组而出现的。CoV棘突蛋白对受体结合、通过构象变化进行膜融合、病毒内化、宿主组织嗜性至关重要，是疫苗开发的关键靶点。因此，本研究旨在确定S糖蛋白的序列变异、结构和抗原差异，这可能有助于2019-nCoV感染的管理。比较2019-nCoV和SARS冠状病毒（SARS-CoV）的刺突糖蛋白序列。使用EMBOSS Needle成对的序列比对工具确定序列变异。NetNGlyc 1.0预测了糖基化位点的变化，并通过N-GlyDE服务器进行了验证。抗原性由NetCTL 1.2预测，并由IEDB Analysis Resource服务器验证。使用SARS冠状病毒刺突糖蛋白的cryo-EM结构，使用SuperPose版本1.0确定结构差异。我们的数据表明，2019-nCoV是在中国新感染的冠状病毒，与SARS-CoV密切相关，其S蛋白与SARS-CoV的差异仅为12.8%，与SARS-CoV的最小受体结合域的相似性为83.9%。2019-nCoV中观察到新的糖基化位点。此外，抗原分析表明两种病毒株之间存在很大的抗原差异，但是发现两个S蛋白之间的一些表位相似。尽管S蛋白的氨基酸组成有所变化，但其结构没有明显差异。总体而言，我们的研究结果首次显示人类2019-nCoV的出现与前SARS-CoV密切相关，2019-nCoV使用各种新型糖基化位点作为SARS-CoV，由于其抗原差异可能会导致大流行。此外，新型细胞毒性T淋巴细胞表位的展示可能为开发肽基疫苗以预防2019-nCoV提供机会。

简介：冠状病毒是冠状病毒科的一个大家族。根据基因组结构和系统发育关系，冠状病毒亚科由α冠状病毒、β-冠状病毒、γ-冠状病毒和δ-冠状病毒组成。α-冠状病毒和β-冠状病毒的传播仅限于哺乳动物，在人类中引起呼吸系统疾病，如SARS冠状病毒（SARS-CoV）和中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV），而γ-冠状病毒和δ-冠状病毒感染鸟类和易感的哺乳动物。基因组编码四种主要的结构蛋白，包括刺突（S），核衣壳（N），膜（M）和包膜（E），这些蛋白可以制成完整的病毒颗粒。进入宿主细胞后，病毒基因组会翻译成两个较大的前体多蛋白，分别为pp1a和pp1ab，它们通过ORF 1a编码的病毒蛋白酶，3C样蛋白酶（3CLpro）和木瓜蛋白酶加工成16种成熟的非结构蛋白（nsp1-nsp16）。这些非结构蛋白（nsps）在病毒RNA复制和转录过程中发挥重要作用。在现有的冠状病毒中，没有校对机制的RNA重组是新型冠状病毒进化和出现的主要原因。在编码病毒棘突（S）糖蛋白的S基因中，重组频率较高。

冠状病毒的感染是由病毒包膜与宿主细胞膜的相互作用引起的。病毒的内化还取决于病毒糖蛋白上潜在的糖基化位点。病毒包膜包含三种蛋白质，其中刺突（S）和膜（M）是两种主要的糖基化蛋白，而包膜（E）是未糖基化的蛋白。M蛋白由短N端糖基化的胞外结构域、三个跨膜结构域和一个长C端CT结构域组成。M和E蛋白是病毒形态发生、组装和出芽所必需的。S糖蛋白是一种1型融合病毒蛋白，由两个被称为HR-C和HR-N的七肽重复区组成，形成被蛋白质外区包围的卷曲螺旋结构。S蛋白裂解为两个亚基S1和S2，其中S1包含最小的受体结合域（270-510），有助于受体结合，而S2促进膜融合。S蛋白对受体结合、膜融合、病毒内化、组织嗜性和宿主范围至关重要，因此是疫苗研制的关键靶点。因此，在本研究中，我们分析了2019-nCoV的S糖蛋白对病毒对宿主细胞受体的附着性的重要性，并将其与之前的参考SARS-CoV菌株的序列变异，糖基化模式，结构和抗原差异进行了比较。 更好地了解病毒的发病机理和抗原性。

研究中使用的序列：为了比较目前流行的新型冠状病毒（2019-nCoV）及之前冠状病毒的棘突基因，我们使用了武汉海产品市场肺炎病毒分离株武汉-Hu-1199ncov（MN908947.3）、武汉海产品市场肺炎病毒分离株武汉-Hu-1199ncov（NC-045512.2），蝙蝠SARS样冠状病毒分离株Bat-SL-CoVZXC21（MG772934.1），蝙蝠SARS样冠状病毒分离株Rs4084（KY417144.1），SARS冠状病毒MA15分离株d3om4（JF292919.1），SARS冠状病毒cive007分离株（AY572034.1）SARS冠状病毒GD03T0013分离株（AY525636.1），其中日本脑炎病毒（AF075723.1）被认为是外群。在系统发育分析中，使用这些序列，用分子进化遗传分析（MEGA）X软件生成树，用简单的凝聚层次聚类方法UPGMA（带算术平均的未加权对群方法）生成树。为了进一步比较目前流行的2019-nCoV和SARS-CoV的S糖蛋白，我们使用了武汉海鲜市场肺炎病毒，保藏号为QHD43416.1和SARS冠状病毒GD03T0013，保藏号为AY525636.1。

序列变化：为了分析棘突糖蛋白序列之间的差异，我们对2019-nCoV和SARS-CoV的完整棘突糖蛋白序列进行了比对。使用氨基酸的标准单字母缩写。 通过在线使用Clustal Omega对共线序列进行比对(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/).。通过使用具有EBLOSUM62矩阵，空位罚分10和扩展罚分0.5的EMBOSS针对配对序列比对工具进行比对进一步验证了此数据。不匹配和缺失被标识为（）；小的正得分被确定为（.）; 得分> 1被标识为（:)，身份被标识为（I）。 此外，我们专门分析了S糖蛋白的最小受体结合域（270–510）中的序列变异。

糖基化模式的差异：为了确定刺突糖蛋白在宿主细胞表面的病毒附着位点的差异，通过NetNGlyc 1.0软件确定了2019-nCoV和SARS-CoV刺突糖蛋白的糖基化位点(https://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)。此外，糖基化位点已通过另一软件N-GlyDE验证(https://bioapp.iis.sinica.edu.tw/Nglyde/help.html)。

抗原变异：使用NetCTL 1.2服务器确定2019-nCoV和SARS-CoV的棘突糖蛋白之间的抗原变异 (https://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/)。服务器预测肽MHCⅠ类结合；蛋白酶体C末端裂解和与抗原处理（TAP）蛋白转运效率相关的转运体。分别测定这两种棘突糖蛋白的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位，并与评分为0.7的表位进行比较。CTL表位由IEDB分析资源的另一个MHC-I结合预测软件验证(https://tools.iedb.org/mhci/)。

结构差异：为了确定结构差异，利用HHPred服务器，用2019株nCoV和SARS-CoV的棘突糖蛋白序列进行蛋白质同源性建模(https://toolkit.tuebingen.mpg.de/tools/hhpred)。基于SARS冠状病毒棘突糖蛋白（PDB-ID-6ACC）的冷冻电镜结构，建立了2019年nCoV（PDBA）和SARS-CoV（PDBB）的S糖蛋白模型。使用SuperPose版本1.0(https://wishart.biology.ualberta.ca/SuperPose/)叠加生成的模型以确定结构差异，该版本使用改进的四元数方法计算蛋白质叠加。根据当地和全球的RMSD值计算结构差异之间的偏差。

结果：系统发育分析与序列比对：

我们的系统发育分析显示，2019-nCoV与蝙蝠SARS样冠状病毒密切相关。然而，2019-nCoV和蝙蝠类SARS冠状病毒都是从SARS冠状病毒中产生的（图1）。暗示2019-nCoV是中国新感染的冠状病毒，与SARS-CoV密切相关。 此外，完整的序列比对数据表明2019-nCoV和SARS-CoV的加标糖蛋白序列具有76.2％的同源性，87.2％的相似性和2％的差异（图2a）。该数据表明2019-nCoV的刺突糖蛋白表现出更高的序列相似性，与SARS-CoV的差异为12.8％。此外，我们研究了最小受体结合域（RBD）从270个氨基酸到510个氨基酸的序列变异，这是其与细胞受体相互作用所必需的。我们发现棘突糖蛋白表现出73.3％的同源性，83.9％的相似性和0.4％的差异，表明存在16.1％的差异，最小RBD的三级结构如图2b所示。S-糖蛋白最小RBD的显著变化表明，2019-nCoV可能在病毒结合能力和对宿主细胞受体的感染性方面发生改变。

图1、2019-nCoV的系统发育 通过分子进化遗传分析（MEGA）软件基于刺突基因序列构建了系统树，显示了2019-nCoV与SARS冠状病毒的前代株的进化关系。 系统发育分析表明，2019-nCoV与蝙蝠SARS样冠状病毒密切相关。然而，2019-nCoV和蝙蝠类SARS冠状病毒都是从SARS冠状病毒中产生的。用于系统发育分析的序列的登录号表示在分支的顶端，其中日本脑炎病毒被用作外群。

图2、棘突糖蛋白的序列变异。a如前所述，显示了2019-nCoV和SARS-CoV的棘突糖蛋白的完整氨基酸序列。使用氨基酸的标准单字母缩写。 通过在线使用Clustal Omega对共线序列进行比对。 氨基酸比对表现出非保守取代（“。”），保守取代（“：”）和半保守取代（“。”）。 保守区域表示为（“”）。在1273个位置中，有76.2％的同源性，87.2％的相似性和2％的差异。 b最小RBD的三级结构（残基270–510）。

棘突糖蛋白糖基化模式的变化：比较两种棘突糖蛋白之间的潜在糖基化位点，见表1。与SARS-CoV相比，我们发现2019-nCoV的棘突糖蛋白具有新的糖基化位点，如NGTK、NFTI、NLTT和NTSN，这可能是序列变异的结果。此外，我们还发现，2019-nCoV棘突糖蛋白显示了常见的糖基化位点，这些位点也存在于SARS-CoV中，如NITN、NGTI、NITN、NFSQ、NESL、NCTF和NNTV（表1）。我们的糖基化数据表明，2019-nCoV可能通过新的糖基化位点与宿主受体相互作用，这些位点可能影响内化过程和相关的发病机制。

棘突糖蛋白的抗原变异：

比较了2019-nCoV和SARS-CoV的棘突糖蛋白的抗原性差异，以确定其抗原性。我们发现大多数CTL表位是SARS-CoV的新表位。然而，在两种棘突糖蛋白中发现六个表位RISNCVADY, CVADYSVLY, RSFIEDLLF, RVDFCGKGY, MTSCCSCLK 和 VLKGVKLHY相同（以斜体表示）（表2）。此外，某些表位被鉴定为具有单个氨基酸的变化（以斜体表示*）。抗原性数据表明，2019-nCoV与SARS冠状病毒的抗原性相似性很小，可能与相似的抗原性反应有关，因此可以作为SARS冠状病毒S糖蛋白肽疫苗的预防策略之一。此外，新的表位可用于设计新的有效疫苗。

表2 2019-nCoV与SARS-CoV棘突糖蛋白抗原性比较

该表显示了武汉-Hu-1-2019新型冠状病毒（2019- nCoV）和SARS冠状病毒-2003（SARS-CoV）棘突糖蛋白中预测的CTL表位的比较。表位由NetCTL 1.2生成，并由IEDB分析资源服务器验证，其中得分大于1.25的表位对MHCⅠ类具有最高的敏感性和特异性。斜体字表示相同的CTL表位，*斜体显示两个棘突糖蛋白之间有一个氨基酸变化的共同表位。

棘突糖蛋白的结构差异：

S糖蛋白序列的12.8%和最小受体结合区的23.6%的差异影响了我们寻找2019-nCoV和SARS-CoV的棘突糖蛋白结构差异。比较生成的模型的结构差异。发现尽管序列中有12.8%的变异，但是棘突糖蛋白之间的结构差异不明显。这一结果表明，为SARS-CoV设计的黏附抑制剂可作为2019-nCoV治疗的当前选择。

图3 棘突糖蛋白的结构差异。2019-nCoV（PDBA）和SARS-CoV（PDBB）的棘突糖蛋白的PDB结构是基于SARS冠状病毒棘突糖蛋白（PDB-ID-6ACC）的冷冻电镜结构。利用嵌合体显示的重叠酶叠加模型，绿色表示SARS冠状病毒的S糖蛋白，青色表示2019-nCoV的S糖蛋白。分析表明，两种结构均显示出不明显的差异，偏差为1.39 A°。

结论：总体而言，我们的研究结果首次显示人类2019-nCoV的出现与前SARS-CoV密切相关。最重要的是，我们的数据提供的证据表明2019-nCoV使用各种新颖的糖基化位点作为SARS-CoV，并且由于其抗原差异可能会导致大流行。此外，新型CTL表位的展示可能为开发肽基疫苗以预防2019-nCoV提供机会。此外，我们对2019-nCoV和SARS冠状病毒中相似抗原位点的揭示表明，SARS相关肽基疫苗可预防2019-nCoV。棘突糖蛋白结构的相似性表明使用冠状病毒特异性黏附抑制剂作为2019-nCoV当前治疗的选择。

原文出自：https://link.springer.com/article/10.1007/s13337-020-00571-5