最新研究发现，约1/3的晚期癌症患者都会发生骨转移，骨癌痛也成为癌症患者最常见的一种疼痛，严重影响了患者的生活质量。虽然随着医学科学的发展，治疗骨癌痛的手段越来越多，但由于存在疗效短暂和药品不良反应等问题，仍有相当一部分骨癌痛得不到理想控制。限制新型疗法出现的关键在于骨癌痛发病机制现在仍不是很清楚。长期以来缺乏可靠的动物模型，阻碍了对骨癌痛发生机制的研究及新型镇痛疗法的研发。直到1999年， Schwei等首次报道了一种小鼠股骨骨癌痛模型。后来Medhurst等又建立了一种世界范围内认可的大鼠胫骨癌痛模型。模型的建立为认识人类骨癌痛的发病机制及治疗研究提供了很好的工具。但在国内，由于受到各个实验室条件及造模用细胞株来源的限制，骨癌痛模型复制仍然是相关课题研究的瓶颈。本章将详细地介绍一种改良版Medhurst大鼠胫骨骨癌痛模型方法。接种细胞后，采用自身对照的方法比较其前后疼痛行为学的变化，在通过X线摄片、HE染色切片证实有无骨损害的发生，来评价检验模型建立是否成功，为骨癌痛相应的一系列研究提供一个适用的工具。

第一节  实验设备及试剂

一、实验设备

实验设备包括光热尾痛测试仪、足底测痛仪、倒置显微镜(DMI6000B)、自动组织包埋机(ZMN-7803)、电热恒温水浴箱、恒温干燥箱、微波炉、冰箱(BCD-203)、光学显微镜(BX41TF)、组织切片机(Leica2135、2145)、微量进样器(5μl)、移液器(1ml)、无菌操作台。

二、主要试剂

Gibco胎牛血清，75％乙醇，0.01moL/L PBS，生理盐水，无菌骨蜡，4％多聚甲醛，PBS固定液，10％、20％、30％的蔗糖，冰冻切片包埋剂，切片保护剂，3.6％水合氯醛，0.25％胰蛋白酶，免疫抑制剂，2.5％头孢噻肟钠。

三、实验试剂的配制

    (一)0.01mol/L PBS的配制

    NaCl    8g

    Na2HPO4·12H2O      3.634g

    KCl    2g

    KH2PO4·2H2O        0.24g

    (1)称取以上试剂量。

    (2)准备容量为1000ml的烧杯盛约800ml的去离子水，依次加入所称取试剂。

    (3)玻璃棒搅拌使其充分溶解，最后定容至1000ml。

    (二)0.25％胰蛋白酶的配制

    (1)准备一个清洗干净且干燥的容量为200ml的烧杯。

    (2)在电子天平上称量胰蛋白酶0.25g，溶解在100ml的0.01mol/L PBS中。

    (3)0.2μm滤膜过滤，分装，储存在-20℃冰箱备用。

    (三)免疫抑制剂的配制

    环孢素一支，规格250mg 5ml，用生理盐水稀释10倍，变成250mg 50ml，浓度5mg/ml。

    (四)3.6％水合氯醛

    称取水合氯醛3.6g，单蒸水定容至100ml，混匀后封口备用。

    (五)4％多聚甲醛-PBS固定液

    取40g多聚甲醛溶解于800ml 0.01mol/L PBS，放于60℃恒温水浴锅中溶解后定容至1000ml。

    (六)2.5％头孢噻肟钠

    1g头孢噻肟钠用40ml生理盐水配制成浓度为2.5％的溶液。

    四、实验所需其他器具

    (一)实验器具

    倒置显微镜、恒温水浴锅、CO2培养箱5ml注射器、10ml注射器针头、组织剪、线剪、弯钳、有齿镊、无齿镊等。

    (二)细胞培养用具

    封口膜、75％酒精棉球、酒精灯、15ml离心管、6孔细胞培养板、1ml无菌枪头、1ml移液器等。

第二节  实验方法

一、体外大鼠乳腺癌细胞株MRMT-1培养

    (一)MRMT-1细胞复苏

    (1)将预热的培养液放到台上。

    (2)穿好无菌手术衣，戴好手套、口罩、帽子，75％酒精棉球消毒手套。

    (3)撕开无菌6孔细胞培养板包装，放入台上，并从饭盒内取出15ml离心管放到架子上。

    (4)撕去培养液的封口膜，75％酒精棉球擦拭瓶口，过火，在离心管中加入9ml培养液。

    (5)培养液瓶口及瓶塞过火，并盖好。

    (6)从-150℃冰箱中取出装有要复苏的细胞冻存管，插入漂板，在37℃恒温水浴锅中游走晃动，将其迅速解冻。

    (7)将解冻的细胞放到台上，75％酒精棉球消毒双手，用75％酒精棉球擦拭冻存管的管口部位，过火，将瓶盖打开，过火，将冻存的含细胞培养液吸出，加入含有9ml培养液的15ml离心管中，马上离心，1000r/min离心10min，去上清液。

    (8)再向其中加入12ml新的培养基(血清为澳洲源血清)，混匀后，接种到培养板中；并在倒置显微镜下观察：细胞悬浮均匀分布。

    (9)放入37℃、5％CO2培养箱进行培养。

    (二)细胞传代

    (1)在倒置显微镜下观察细胞生长情况，发现细胞已经占据整个培养板每孔的80％～90％，开始传代。

    (2)准备实验所需要的乙醇和酒精棉球，并将使用的培养液放入恒温培养箱预热。

    (3)紫外灯消毒实验台30min。

    (4)戴帽子、口罩，并穿上隔离衣，戴手套；将打包消毒的枪头盒和EP管放入超净台，准备开始传代。

    (5)将要冻存的细胞培养板和预热的培养液从培养箱中取出，放进刚喷洒酒精的超净台上，用酒精棉球擦手消毒。

    (6)去掉盛有培养液的瓶子口的封口膜，用酒精棉球擦瓶口和瓶盖的连接处，酒精灯外焰过火，放在酒精灯左侧。

    (7)揭开培养板，盖朝下放置，拿起培养板，与超净台平面成45°角，用移液枪贴住每个培养孔下边吸取培养液丢弃，用PBS冲洗1次，去掉PBS，加0.25％胰酶消化，刚好覆盖过细胞为止，盖上盖子，室温消化2～3min。

    (8)用带血清的培养液终止消化，开始轻轻吹打，使贴壁的细胞悬浮起来。

    (9)收集到离心管中，离心细胞，1000r/min离心10min。

    (10)去掉培养基，加入新的培养基12ml，制成细胞悬液，进行细胞计数。

    (11)将细胞悬液稀释至2×100000个/ml的细胞密度进行接种。

    (12)置入37℃、5％CO2的培养箱进行培养。

二、骨癌痛模型的复制

    参考Medhurst等报道的方法，建立大鼠骨癌痛模型。

    (1)选择清洁级成年雌性SD大鼠20只，随机分为两组，假手术组(对照组)和骨癌痛模型组(实验组)。

    (2)腹腔注射3.6％水合氯醛1ml/100g，麻醉起效后，取仰卧位固定。

    (3)左侧后肢剪毛，皮肤用碘伏消毒，铺无菌洞巾。

    (4)在胫骨上段(膝关节下约5mm)皮下组织最薄处切开1cm小口，钝性分离皮下组织，小心暴露胫骨。

    (5)用10ml注射器针头分开局部骨膜，垂直于术区胫骨骨面钻孔，以食指托住胫骨对抗钻孔用力，尽量保持后肢膝关节屈曲功能位，避免牵拉，有突破感提示已进入骨髓腔。

    (6)用10μl微量注射器缓慢注入3μl含3×1000个的MRMT-1大鼠乳腺癌细胞，注射完毕后用无菌骨蜡仔细封堵针孔。假手术组注入等量生理盐水。

    (7)生理盐水清洗创口，皮肤缝合。

    (8)术后抗感染(2.5％头孢噻肟钠)治疗。

三、骨癌痛模型的评价

    评估大鼠不同时期的疼痛行为学(术前1天、术后1周每周温痛觉检查，至术后4周；成都市高新区四川大学转化医学中心测试大鼠下肢机械压痛觉和尾部温热痛觉阈值，实验过程中保持室内安静)、局部组织学、影像学改变(术后4周取材做胫骨X线及HE染色)，以确保模型复制成功。

    (1)大鼠机械痛觉检测：足底测痛仪检测砝码为20g，标尺刻度0～25，压爪质量＝标尺刻度×20g，大鼠左右下肢分开测定，测定时将其下肢掌中部放在平台上，然后开始测定，缓慢移动测试标杆直至压力达到一定阈值时大鼠将其下肢抽回，记录此时的标尺刻度，共测4次，每次测试相隔1min以上，第1次数据不计，后3次数据求平均值。

    (2)大鼠热痛觉检测：将光热尾痛测试仪红外灯强度设为80℃，时间阈值为22g，每只大鼠放入固定器后不能立即进行热痛觉检测，一般先让其安静1min左右然后开始检测，测定时将大鼠尾部后1/3处放在红外灯处，按开始键后，开始计时，当热刺激到一定阈值时大鼠尾巴摆动，离开红外灯处，计时立即停止，读取此时的时间。共测4次，每次测试相隔1min以上，第1次数据不计，后3次数据求平均值。

四、统计方法

    采用SPSS 16.0统计软件分析，数据以x-±s表示，组间比较采用单因素方差分析，组内不同时间点的比较采用重复测量资料的方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

第三节  实验结果

一、疼痛行为学改变

如图23-1所示，假手术组大鼠与骨癌痛组大鼠术前机械痛缩爪阈值无差异(P>0.05)，假手术组大鼠术前机械痛缩爪阈值与术后7d、14d、21d、28d相比略呈下降趋势，但无统计学意义(P>0.05)。骨癌痛组大鼠术后7d、14d、21d、28d与术前相比下降显著，有统计学差异(P<0.05)，与同时间假手术组相比也明显下降，有统计学差异(P<0.05)。大鼠热痛甩尾阈值呈现相同的变化趋势(图23-2)。

二、X线检查结果

大鼠胫骨X线片如图23-3所示，大鼠肿瘤细胞注射侧胫骨出现明显的骨质破坏，骨质破坏的程度与造模时间呈正相关，时间越长，破坏越重。到第28天，骨质破坏进一步加重，骨皮质呈虫食状缺失。而假手术组胫骨x线照片未显示明显的骨质破坏。图23-3是大鼠下肢胫骨平台处X线片，显示下肢胫骨平台处局部骨质密度减低，骨小梁稀疏，正常骨结构消失，单侧骨皮质缺失。

三、组织学观察结果

图23-4为骨癌痛大鼠胫骨石蜡切片、苏木素-伊红染色(HE染色)，显示造模大鼠骨髓腔有肿瘤细胞(白色箭头)及大量破骨细胞(黑色箭头)。

第四节  经验体会及注意事项

    (1)细胞培养过程要严格无菌操作，在超净工作台上完成实验操作。这对于细胞的复苏和传代十分重要。

    (2)大鼠手术操作中去毛、无菌操作和术后抗感染对于模型的建立是必不可少的。要绝对杜绝术后手术部位的感染，如果手术部位出现炎性感染，会出现炎性痛，严重干扰正常结果。

    (3)胫骨钻孔时，尽量选择皮下组织和肌肉少的部位，将皮下组织、骨膜与穿刺部分骨面分离完全，避免软组织夹入钻孔中。如果皮下组织和肌肉过多，在分离和暴露的过程中损伤严重，会产生疼痛，干扰正常结果。

    (4)穿刺时一定要垂直骨面，尽量减少对胫骨骨质的破坏，否则胫骨的抗压能力受损。容易发生穿刺处骨折。

    (5)术后必须仔细进行无菌骨蜡密封，以防肿瘤细胞自穿孔处外逸。骨髓腔内压力增高是形成骨癌痛的原因之一，肿瘤的外向生长，减轻了骨髓腔内压，缓解了疼痛，不利于实验检测。

    (6)痛阈水平检测属于感觉检测，易受外界因素干扰，所以进行行为学测痛检查时，一定要保持环境安静，并且给大鼠一定时间适应检测所处的环境，以保证检测的稳定性。

    (7)组织固定的好坏是影响免疫组化结果的关键因素。组织标本离体后30min内应放入固定液或低温保存，最佳的固定液应该是中性甲醛溶液，固定时间为12～24h。中性甲醛溶液渗透力强，固定均匀，对组织收缩小，无论是对HE切片还是免疫组化都是最好的固定液。