新冠靶点新视角三：免疫调节相关因子LY6E和CD209L
对于新型冠状病毒的相关信息，我们一直在进行深入调研，希望能为科研助一臂之力。前面的推文中我们已经提到了细胞因子风暴、跨膜蛋白酶等在新型冠状病毒入侵宿主时所发挥的作用，那么除了这些，还会有别的因子起作用吗？它们又扮演着怎样的角色呢？根据调研，我们发现LY6E和CD209L两类免疫调节相关的蛋白在病毒与宿主受体作用时发挥了作用，下面进行详细说明。
LY6E
LY6E与病毒相关的研究从2000年才开始逐渐发展起来，2001年报道了LY6E在一种致癌性禽疱疹病毒引起的马立克氏病中的差异表达。之后研究发现LY6E蛋白可以增加宿主对于I型小鼠腺病毒（MAV-1）以及HIV-1的易感性，除了这些，LY6E还与许多RNA病毒的感染增强有关，比如黄热病病毒（YFV）、登革热病毒（DENV）、寨卡病毒（ZIKV）、甲型流感病毒（IAV）等。在机理研究方面，已有研究证明GPI锚定的蛋白与细胞骨架重排相关，如果LY6E参与了骨架重排，那么这对病毒进入细胞来说也是非常关键的，也就是说，LY6E分子有可能参与了病毒颗粒被宿主细胞内化的过程。
LY6E对病毒感染的作用机制是怎样的呢？有直接作用和间接作用，这取决于LY6E如何调节病毒感染，以哪种类型的细胞感染以及病毒本身的特异性：
● 首先，LY6E是GPI锚定的蛋白质，富含脂筏微结构域，调节内吞运输和信号传导等膜依赖性过程，可以影响病毒糖蛋白或受体蛋白的表达及生物学特性，从而影响病毒与受体的结合、运输以及膜融合。在HIV-1的研究中，已经表明LY6E是通过调节病毒半融合状态来促进病毒融合并增强其进入细胞的能力。
● 其次，GPI锚定的LY6蛋白可以调节细胞骨架的重排，从理论上讲，GPI锚定的蛋白质可能不会与细胞骨架分子直接发生相互作用，因为它们无法进入细胞内部，而正因为这样，这些蛋白质可以与多种跨膜分子关联，例如Src家族激酶和整合蛋白，这种间接的相互作用可以调节细胞骨架的结构，也就是说，LY6E对不同病毒的感染力增强或者减弱，很大程度是由LY6E对细胞骨架重排上的影响造成的，具体是增强还是减弱，可能还跟细胞类型和病毒本身的特异性相关。
● 第三方面，LY6E可以调节包括宿主免疫应答在内的细胞信号转导，这对病毒感染的预防非常重要。我们都知道，细胞因子、趋化因子等参与了IFN-I信号转导，通过一系列的信号级联反应促使机体对病原体的清除。研究表明，细胞表面的LY6E的抗体交联激活了T细胞，而T细胞的生理活性会影响到病毒的感染和存活。Yeom等人的研究表明LY6E可以通过PTEN/PI3K/Akt/HIF-1轴来调节肿瘤的生长，特别是在转录水平下调PTEN而上调HIF-1α基因。LY6E和LY6K还可以通过改变TGFβ依赖性的乳腺癌细胞的生理机制而参与乳腺癌的增殖，而TGFβ广泛参与病毒感染和发病机制，研究证实，LY6E与先天性免疫信号之间可直接相互作用，LY6E下调CD14，而CD14是TLR4/CD14/NF-κB通路的关键分子，这会导致先天性免疫激活产生负反馈回路，为病毒的感染提供了新的路径。需要指出的是，LY6E是质膜靶向蛋白，但也可以在细胞内表达。
有趣的是，Katrina B. Mar等人通过抗病毒ISG筛选，发现LY6E增强了病毒感染，研究结果显示，在不同细胞中易位表达LY6E增强了多种RNA病毒的感染性，LY6E不会损害IFN的抗病毒活性或信号转导，但是会促进病毒进入细胞。
2020年3月5日瑞士伯尔尼大学病毒学与免疫学研究所Stephanie Pfaender等发现LY6E可以破坏冠状病毒与宿主细胞融合，并调控免疫进程。这篇文章发表在bioRxiv上。冠状病毒具有广泛的宿主嗜性，有越过物种壁垒感染人类的能力，哺乳动物的先天免疫应答有部分是通过干扰素来控制的，干扰素诱导多个基因来抑制病毒感染，其中就包括LY6E。而在人类、恒河猴、小鼠、蝙蝠和骆驼来源的LY6E直向同源物的比对解释了物种间的强保守性。这篇研究展示了LY6E有效地限制了由多个冠状病毒引起的细胞感染，包括SARS-CoV，SARS-CoV-2和MERS-CoV，研究表明，LY6E通过干扰spike蛋白介导的膜融合来抑制冠状病毒进入细胞。在实验中，研究者用到了造血干细胞中缺乏Ly6e的小鼠和Ly6e基因敲除小鼠，二者都极易受到冠状病毒的感染，且发病程度加剧，伴随着肝、脾脏免疫细胞的丢失和整体抗病毒感染途径的减少等现象的出现。
对于LY6E在冠状病毒中的研究我们还需要进一步去证实，鉴于该基因目前的功能，我们对SARS-CoV-2又有了新的了解，对抗病毒药物的研发无疑又是一个新的启发。
L-SIGN（CD209L）
C型凝集素是在抗原呈递细胞上的跨膜蛋白，能够以钙依赖性的方式对糖类复合物中的碳水化合物进行特异性识别。在免疫反应过程中C型凝集素介导细胞间的相互作用，识别内源性受体，并且维持内源性糖蛋白的稳态。DC-SIGN是一种在树突状细胞（DC）表面表达的C型凝集素，可与HIV和猿猴免疫缺陷病毒有效结合并传播给易感细胞。C型凝集素还有一种是DC-SIGNR，也称为L-SIGN和CD209L。在某些情况下，C型凝集素是病原体（包括病毒、细菌、寄生虫和真菌）侵袭细胞的受体，最典型的是DC-SIGN，在未成熟的DC和巨噬细胞亚群中均有表达，而L-SIGN与DC-SIGN具有77%的氨基酸序列同源性，可感染淋巴结和肝窦内皮细胞，与丝状病毒、冠状病毒、淋巴细胞性脉络膜脑炎病毒等的感染相关。
Stefan Pohlmann等人在2001年时就发现了L-SIGN与DC-SIGN相似，可以与HIV-1、HIV-2和猿猴免疫缺陷病毒等毒株结合，引起T细胞系和人外周血单核细胞的感染。Bashirova AA等在“树突状细胞特异性胞间黏附分子3（ICAM-3）与DC-SIGN相关蛋白在人肝窦内皮细胞上高表达并促进HIV-1感染”的研究中表明，L-SIGN与DC-SIGN相比，对ICAM-3具有更高的亲和力，通过与ICAM-3的结合，增强T细胞对HIV-1的敏感性。
病毒与L-SIGN的结合取决于碳水化合物的识别，而与病毒结合的黏附因子在多种内皮细胞中的存在表明L-SIGN可以通过与不同器官内皮细胞黏附分子结合而实现在细胞间的活动，使HIV-1能够穿越某些器官的毛细血管内皮以及在病毒呈递中发挥作用，HIV包膜（Env）蛋白与细胞表面分子之间的相互作用决定了哪些细胞易受到病毒侵袭以及侵袭的效率。树突状细胞（DC）能够帮助结合的病毒有效地传到外周单核细胞，即使DC本身未受到感染或感染效率低下，也能导致单核细胞强烈的感染。Leah GiLlespie的研究发现，DC-SIGN和L-SIGN是促进人偏肺病毒（human metapneumovirus，HMPV）感染靶细胞的附着因子。Marzi等人的研究证明，SARS-CoV Spike糖蛋白的逆转录假病毒可以与DC-SIGN和CD209L结合，但不依赖于这些凝集素进入细胞，同时他们还证明了CD209L在肝窦内皮细胞、Peyer‘s淋巴细胞、回肠末端绒毛固有层的毛细血管以及II型肺泡细胞和肺内皮细胞中对SARS-CoV具有受体活性。
Jeffers SA等用编码CD209L的cDNA转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO），发现这些细胞对SARS-CoV变得敏感，进一步的研究表明CD209L可能是SARS-CoV的一种弱受体，同时，研究还证明了CD209L对于hCoV229E来说，是一种比hAPN活性更弱的受体。而SARS-CoV可能通过S蛋白上的高甘露聚糖与质膜上的CD209L结合，然后介导病毒进入宿主细胞。显然，CD209L蛋白在病毒和宿主细胞表面起到了桥梁的作用。已经有报告证明，树突状细胞上的DC-SIGN是埃博拉病毒、HIV-1和其他包膜病毒的附着因子，树突状细胞是专业的抗原呈递细胞，可将病毒呈递给巨噬细胞或者CD4+T细胞。
Dong P. Han等在对SARS进行研究的时候发现，DC-SIGN和L-SIGN介导的SARS病毒感染的关键位点是特定的天冬酰胺连接的糖基化位点，他们提到，S糖蛋白上的高甘露聚糖对DN/L-SIGN介导的病毒感染很重要，定点诱变分析已经鉴定出S蛋白上7个关键的糖基化位点，分别是109，118，119，158，227，589和699位的天冬酰胺残基，而我们知道，病毒S蛋白RBD结构域与ACE2结合的氨基酸残基位于318-510区域。从动物到人类分离的SARS-CoV编码S蛋白氨基酸序列分析表明，糖基化位点N227和N699促进了人畜共患病的传播。Zhi-Yong Yang等人的研究发现，SARS-CoV的S糖蛋白可以通过pH依赖的方式介导细胞的内吞作用使病毒进入。2008年香港学者US Khoo等表明L-SIGN的多肽区域变体的杂合表达可能会改变病毒与配体的结合能力，而炎性因子在SARS感染中同样起作用，这些都有助于增加SARS的易感性。Vera S F Chan等发现，与L-SIGN杂合的细胞相比，L-SIGN纯和的细胞显示出更高的与SARS-CoV结合的能力，更高的蛋白酶体依赖性病毒降解能力和更低的反式感染能力，因此，他们认为，L-SIGN的纯和性在SARS感染期间对机体起保护作用。
另外，也有研究表明，肺表面活性蛋白D（SP-D），该C型凝集素超家族成员包含与CD209L类似的碳水化合物识别结构域，是一种重要的宿主先天防御分子，可与细菌和病毒表面的高甘露聚糖结合，被SP-D包被的细菌和病毒形成聚集体，被巨噬细胞吞噬，由于可溶性CD209L可以与hCoV-229E病毒体结合并增强病毒与受体细胞的结合，因此SP-D也可能与hCoV-229E结合并介导病毒的黏附、侵入以及最终进入巨噬细胞和II型肺泡细胞。此外，肺泡表面活性剂在保护肺方面的作用不容小觑，它可以通过中和过度炎症反应过程中所产生的氧化自由基，来达到保护目的。因此，SP-D为药物研发方面也提供了一种非常有用的途径。
综上所述，我们对SARS-CoV-2的研究，需要从更广泛的角度去理解病毒与受体之间的结合方式，才能在更深入的了解病毒的特征基础上做出针对性的抗病毒制剂。共同攻坚，我们一起努力。
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