肆虐在外的病毒，你怕了吗？无限期的假期，你胖了吗？在家陪老爸喝酒，微醺过吗？你有听说过肥胖导致的非酒精性脂肪肝吗？瑟瑟发抖中......

据调查，对人类健康威胁较大的肝病包括：肝实质细胞损伤、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、非酒精性脂肪变性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis, NASH）、肝硬化和肝癌。

众所周知，肝病研究、开发治疗各类肝病的有效药物离不开动物模型。但是关于肝病小鼠模型你知道多少呢？就以上威胁人类健康较大的肝病做简略模型介绍。

01.肝损伤模型

肝损伤主要指肝实质细胞的功能损伤或坏死。临床肝损伤主要由饮酒、食物中毒、药物毒性、病毒性肝炎、脂肪肝、肝硬化及胆汁淤积症等引起。严重的急性肝损伤可发展为肝衰竭，危及生命；慢性肝损伤则可能向肝硬化、肝癌的终末期发展。

而肝损伤小鼠模型模型可以用于肝损伤-修复、肝再生机理性研究，也可用于保肝、治疗肝损伤药物的筛选、评价，因此肝损伤小鼠模型的研究意义重大。

1、常见研究方法：

通过化学物质（如 CCl4、D-氨基半乳糖、黄曲霉毒素等）诱导或者肝血管、胆管结扎手术等理化方法可以引起动物肝脏损伤。但化学物质诱导是比较剧烈和不可逆的，不能模拟临床更多见的非化学肝毒性因素的肝损伤的病理状态和机制。通过遗传性的生物学方法造成肝损伤模型可以克服这个问题，并可获得大量特性均一的动物模型。

2、模型研究：

研究发现，小鼠肝脏特异性过表达尿激酶型纤溶酶原激活蛋白（urokinase-type plasminogen activator，uPA）可引起肝细胞坏死，即 uPA 转基因小鼠可以作为肝损伤模型。但是 uPA 转基因鼠的缺点是死亡率高，难于繁殖。基于此，北京维通达利用基因工程方法开发了可调控的更接近生理性条件的肝损伤模型 Tet-uPA 转基因小鼠。

这种小鼠转入了两个基因片段，Alb-rtTA 和 TRE-uPA，构成在肝细胞内特异表达的 Tet-On 系统调控的 uPA 转基因结构。Tet-uPA 小鼠在不诱导的情况下是完全健康状态，可以正常繁殖；当用四环素类药物 Dox 诱导时，uPA 在肝细胞内表达，引起肝损伤。既可以用高剂量 Dox 诱导产生急性肝损伤甚至肝衰竭的表型，也可以用较低剂量持续诱导成为慢性肝损伤模型。因而 Tet-uPA 小鼠是肝损伤机理研究和保肝药物药效评价的理想模型 [1]。同样是经基因操作敲除 Fah 基因的小鼠也是一种肝损伤模型。

02.乙肝和丙肝病毒模型

乙型肝炎病毒（HBV）可以引起肝脏的急、慢性感染，其中慢性感染是引起严重肝脏疾病的主要病因。

1、病毒治疗方法：

传统治疗乙肝的抗病毒药物包括干扰素类和核苷类似物（拉米夫定、阿德福韦和恩替卡韦等）。口服核苷类似物可以有效降低病人体内 HBV DNA 的水平，但存在停药后病毒暴发的危险，并且长期服用又会导致病毒抗药性的产生。干扰素虽能通过抑制病毒 DNA 复制和激活机体抗病毒免疫来达到治疗效果，但是在接受干扰素治疗的病人中只有不足 10% 产生持续的治疗作用。若任由乙肝病毒继续繁殖及发展的话，最终的结果可能会演变成肝硬化甚至肝癌。

2、常用的 HBV 小鼠模型：

可简单分为 5 类：（1）转基因小鼠，将 HBV 基因组片段直接转入小鼠胚胎中，小鼠模型可终生表达 HBV；（2）水动力注射模型，将 HBV 质粒 DNA 高压注射到小鼠体内；（3）AAV 载体转染模型，通过腺相关病毒携带 HBV 基因组进入小鼠的细胞中；（4）人鼠嵌合肝脏小鼠感染模型，是目前最完备的 HBV 感染模型，可以完全再现 HBV 感染、复制、包装和释放及再感染的整个生命周期，可以产生最关键的 cccDNA；（5）肝脏和免疫系统双人源化小鼠模型，最理想的肝病研究模型。这 5 类模型各有优缺点（详见表 1）

3、丙肝病毒（HCV）小鼠模型：

丙肝病毒（HCV）也是一种人类肝细胞专嗜性病毒，只能感染人和与人类非常接近的灵长类，长期以来都没有可用的小动物模型。将 HCV 在人肝细胞膜表面表达的受体基因转入小鼠，可使小鼠感染 HCV，但是病毒并不能在小鼠肝细胞内有效复制。但也发现，应用人源化肝脏小鼠则可以建立真正的 HCV 感染小鼠模型 [2]。

03.脂肪肝、NASH、肝纤维化、肝硬化和肝癌模型

非酒精性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种世界流行的慢性疾病，伴随着肥胖与其他相关因素的增长，NAFLD 在过去的 20 年里的发病率爆发式的增长。NAFLD 如果不能得到有效治疗，会逐渐进展到非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝纤维化（Fibrosis）。此时通过干预，肝脏仍能恢复正常，一旦进展到肝硬化（Cirrhosis），将会有约 1~4% 的患者进展为肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）（见图 1）[3,4]。

图 1 非酒精性脂肪性肝炎（NASH）和肝癌（HCC）发病的阶段及特征

1、NASH 药物研发进展

目前的假说认为 NASH 是多种因素共同作用的后果，包括遗传、肥胖、代谢综合症（比如高血压、高血糖、腹部脂肪堆积，以及它们导致的心血管疾病与二型糖尿病）、糖尿病等。

NASH 发病机制复杂，这就导致了 NASH 药物的作用靶点相对较多，不过大致遵循了二次打击假说的轨迹。目前在研药物主要针对 3 个方面：脂肪、炎症、纤维化，其中代谢类靶点又可细分为脂类、葡萄糖、胆酸类三个靶点，炎症靶点包括氧化压力、炎症和免疫系统多方面的靶点（见表 2）[5]。

2、NASH 和 HCC 大小鼠模型的研究进展

动物模型在阐明 NAFLD 、NASH 和 HCC 病理生理机制以及新药的开发中起着重要的作用。

（1）肝脏细胞特异性启动子转基因，或者突变与肥胖等相关的基因；
（2）肝特异病毒质粒注射；如 AAV-HBV 注射；
（3）高压水动力注射；
（4）肿瘤细胞的原位或易位移植。肿瘤细胞移植简便易行，同种遗传背景来源的肿瘤（GEM-derived allograft  models，GDA）移植模型，已经成为 HCC 研究中最为重要的体内实验模型。

根据模型制作方法及病理特征，可以将临床前常用的动物模型分为四类：饮食诱导模型、化学物质和饮食诱导模型、基因编辑和饮食诱导模型和人源化复合模型等 [6]。可见 NASH 动物模型可通过饮食诱导、基因改变或者多种手段共同干预的方式建立。

很多模型在组织病理上的变化与临床 NASH 很相似，但是肝脏的代谢、转录特点可能并不一致。因此动物模型不应仅在组织学上还应该在蛋白质组、脂质组和转录组等基础上评估模型与临床疾病的相关性。其中一些转录组特征包括免疫信号、脂质代谢、糖代谢改变。

正常小鼠（比如 C57/BL6）给予蛋氨酸-胆碱缺乏饮食（MCD）和胆碱缺乏、L-氨基酸补充（CDAA）的饮食可以形成与 NASH 相似的病理组织如肥胖、炎症、纤维化。然而，胆碱缺乏饮食诱导的模型与临床 NASH 发病机制无关，因为胆碱缺乏会阻止肝脏脂质合成通路。

此外，小鼠模型会出现体重下降而不是升高的特点，同时也不会出现胰岛素抵抗现象，而临床 NASH 患者也不会出现胆碱缺乏。这些强调了动物模型中肝脏甘油三酯积累的潜力，但在病理生理学上却无法模拟临床 NASH。

其他因素，比如环境温度，也可能会影响 NASH 动物模型的疾病程度，当喂养高脂食物时，在热中性环境条件下饲养更符合人类疾病状态。采用西方饮食及每周腹腔注射 CCl4（肝毒素，可放大损伤和纤维化）诱导的 NASH 动物模型也与临床 NASH 高度相似。

3、解决方案

维通达可以提供各种类型的肝相关疾病模型，满足药物研发与治病机理的研究（见表 4）。使用维通达提供的肝相关动物模型和服务，已经几十篇 paper 发表在高影响因子的核心期刊，并成功用于新药的 IND 申报 [7-15]。

不同方法制备的脂肪肝动物模型的表型和形成机制各异，按照研究的目标选择最适合的动物模型，尽量选择与人类疾病相似、方法简单、成功率高、和重复性好的实验模型。

合理的选择这些模型，将有助于加快药筛进程、验证新疗法和更快解决 NASH 和 HCC 生物学发病机制等方面的问题。北京维通达生物技术公司将研发提供各类肝病动物模型作为公司战略布局之一和重要的业务领域，已开发出多种肝病相关小鼠模型，可满足科研机构、医药研发实体对动物模型的多种需求。

此外，维通达可现货供应表达 hACE2 的多种细胞系（hACE2-HeLa 细胞系、hACE2-3T3 细胞系、hACE2-COS7 细胞系）可用于机理机制的研究、疫苗和抗病毒药物的体外鉴定和筛选。

参考文献：

[1] A Mouse Model of Inducible Liver Injury Caused by Tet-On Regulated Urokinase for Studies of Hepatocyte Transplantation.The American Journal of Pathology.Volume 175, Issue 5, November 2009, Pages 1975-1983.
[2] Humanized Mouse Models for the Study of Hepatitis C and Host Interactions.Cells. 2019 Jun; 8(6): 604, Pages 1-27.
[3] New trends on obesity and NAFLD in Asia.J Hepatol. 2017 Oct;67(4):862-873.
[4] Cell-Free Circulating Nucleic Acids as Early Biomarkers for NAFLD and NAFLD-Associated Disorders. Front. Physiol., 20 September 2018
[5] 浅谈国内外 NASH 药物，谁将拔得头筹？药渡 2019-07-04
[6] Preclinical Models for Studying NASH-Driven HCC: How Useful Are They?Cell Metabolism 29, January 8, 2019
[7] HBV 小鼠模型该如何选择？一文教会您.VitalStar 维通达动物模型专家 2019-07-11
[8] Pathological features of liver inflammation and fibrosis in hepatitis B virus transgenic mice C57BL/6N -Tg(1.28 HBV) /Vst . Chin Hepatol, 2018, 23(1): 26-30.
[9] Comparison of two composite mouse models of hepatitis B fibrosis.Huang K,Sun X,Zhao ZM, et al. Acta Lab Anim Sci Sin. 2019,27(5).
[10] Removal of Integrated Hepatitis B Virus DNA Using CRISPR-Cas9. Front. Cell. Infect. Microbiol. 7:91.doi: 10.3389/fcimb.2017.00091
[11] Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro. Science. 2019, 364(6438):399-402.
[12] A two-step lineage reprogramming strategy to generate functionally competent human hepatocytes from fibroblasts. Bingqing Xie, Da Sun, Yuanyuan Du ... & Hongkui Deng.Cell Research. Published Jul 03, 2019.
[13] LncRNA PCNAP1 modulates hepatitis B virus replication and enhances tumor growth of liver cancer.Theranostics. 2019 Jul 9;9(18):5227-5245. doi: 10.7150/thno.34273. eCollection 2019.PMID:31410212
[14] Human hepatocytes with drug metabolic function induced from fibroblasts by lineage reprogramming. Cell Stem Cell. 2014 Mar 6;14(3):394-403
[15] HAT1 signaling confers to assembly and epigenetic regulation of HBV cccDNA minichromosome.Theranostics. 2019 Sep 25;9(24):7345-7358. doi: 10.7150/thno.37173. eCollection 2019.