摘要：老年性黄斑变性（AMD）是发达国家致盲的主要原因，其分子发病机制尚不清楚。大量证据证实了神经营养素在视网膜细胞的发育、增殖、分化和存活中的关键作用。神经营养素剥夺被认为是导致视网膜细胞死亡的神经退行性疾病。在生理衰老和AMD背景下，视网膜中神经营养素（前神经营养素）的未成熟形式及其成熟形式[例如，神经生长因子（proNGF和mNGF）和脑源性神经营养因子（proBDNF和mBDNF）]的表达尚不清楚。此外，尚不清楚AMD发育过程中视网膜蛋白NGF和BDNF的细胞特异性定位。在这里，我们评估了年龄相关的神经营养素系统改变对OXYS大鼠AMD样视网膜病变的影响。

方法：采用临床前期（20 天）、早期（3 个月）、晚期（18 个月）的雄性OXYS大鼠和年龄匹配的雄性Wistar大鼠（作为对照）。我们用荧光显微镜在OXYS和Wistar大鼠视网膜切片上对NGF、BDNF及其受体TrkA、TrkB和p75NTR进行了免疫组化定位。

结果：我们发现18月龄大的OXYS大鼠（视网膜病变的进展阶段）的Muller细胞中NGF染色增加。相反，在OXYS大鼠发生AMD样视网膜病变的过程中，我们只观察到成熟BDNF（mBDNF）和TrkB标记的细微变化。利用波形蛋白和NeuN的共定位，我们检测了OXYS和Wistar大鼠mBDNF细胞类型特异性定位的差异。结果表明，OXYS大鼠mBDNF蛋白存在于Muller细胞中，而Wistar视网膜中的mBDNF免疫反应性存在于Muller细胞和神经节细胞中。在AMD样视网膜病变的发展过程中，proBDNF在增加OXYS视网膜细胞丢失过程中占主导地位。

结论：这些数据表明视网膜神经营养因子平衡的改变与OXYS大鼠AMD样视网膜病变的发生有关，并证实其参与了人类AMD的发病机制。

背景：老年性黄斑变性（AMD）是一种复杂的神经退行性疾病，可导致老年人的中心视力丧失。AMD的发生是基于视网膜色素上皮（RPE）、Bruch膜和脉络膜毛细血管的年龄相关变化，但从典型的年龄相关变化到病理过程的确切机制尚不清楚。AMD的特征是神经元和光感受器的逐渐丧失，从而导致失明。视网膜细胞死亡是由复杂的机制控制的，目前尚不清楚。这种状况阻碍了AMD有效治疗方法的发展。神经生长因子（NGF）和脑源性神经营养因子（BDNF）等神经营养因子在老年痴呆、AMD等神经退行性疾病的发生、发展中起重要作用。据我们所知，神经营养素在AMD病理生理中的作用尚未在文献中阐明。成熟的NGF和BDNF（mNGF和mBDNF）是由其前体（proNGF和proBDNF）经胞外空间的蛋白水解裂解而来。成熟和前体形式对细胞有相反的作用。已知成熟的神经营养蛋白与受体Trk的结合可调节神经元细胞的生长，存活，分化，功能和可塑性。mNGF是酪氨酸激酶受体原肌球蛋白受体激酶a（TrkA）的首选配体，mBDNF是TrkB的首选配体。ProNGF和proBDNF以高亲和力与p75NTR和共受体sortilin结合，从而增加细胞凋亡。NGF和BDNF对靶细胞的作用取决于成熟型与前体型的比例，以及共同分布于细胞表面的受体类型。然而，由于特异性抗体的限制，很少有研究能够区分NGF和BDNF的成熟形式与前体形式。视网膜是中枢神经系统（CNS）的一部分，尽管有关NGF和BDNF视网膜表达的文献很多，但对于正常衰老的视网膜和受AMD影响的视网膜之间神经营养蛋白表达的差异知之甚少。另外，参与AMD发展过程的视网膜细胞中NGF和BDNF蛋白的确切定位及其功能意义尚不清楚。

有证据表明，适合AMD的实验模型是衰老加速的OXYS大鼠，该大鼠自发形成与人类年龄相关疾病相似的表型（包括AMD样视网膜病）。OXYS大鼠早期发生的视网膜病变（就临床表现和形态特征而言）就相当于人类AMD的干燥萎缩形式。但是，这些大鼠中有一些（〜10％到20％）随着年龄的增长形成

新血管。OXYS大鼠100％在3个月大时出现AMD样视网膜病变的临床体征，其RPE横截面积减少，脉络膜微循环障碍和视网膜变薄。OXYS大鼠10月龄前的异常有光感受器细胞层厚度的显着减少和外核层（特别是在中央部分）的光感受器细胞核数量的减少。RPE的显著病理变化表现为RPE区脂褐素和淀粉样蛋白的过度积聚。RPE形态紊乱，包括多核细胞比例增加，肥大，细胞形状改变和反应性神经胶质增生。我们假设神经营养因子参与了OXYS大鼠的神经元视网膜变性。因此，本研究的目的是评估OXYS和对照Wistar大鼠视网膜中mNGF、mBDNF、proBDNF及其受体的细胞类型特异性表达的年龄相关变化，以及神经营养因子对OXYS大鼠AMD样病理发展的贡献，包括临床前阶段。

从俄罗斯科学院西伯利亚分院细胞遗传学研究所的繁殖实验动物实验室获得雄性衰老加速型OXYS大鼠在疾病的临床前阶段（年龄20天），疾病早期（3个月）和晚期（18个月）（每个年龄组四只）和年龄相匹配的雄性Wistar大鼠（作为对照）。OXYS大鼠品系来自细胞遗传学研究所的Wistar大鼠品系，并已在大鼠基因组数据库中注册。

免疫荧光染色：

摘取大鼠眼球于新鲜4%多聚甲醛溶液中固定2h，在PBS中冲洗3次，然后在蔗糖梯度溶液（10,20,30%）中冷冻保存。将后眼杯埋入Killik中，冷冻，并保存在−80°C下。在微型HM-505 N低温恒温器上于− 20°C下制备组织切片（厚10μm厚），转移至Polysine®载玻片（Menzel-Glaser）上，并于− 20°C下保存。将切片在5％BSA中与0.1％Triton X-100的PBS中孵育1h，然后在4°C下与一抗NGF（1：100），TrkA（1250），proBDNF（ 1：100;），mBDNF（1：250;），TrkB（1：100;），p75NTR（1：100;），NeuN（1：200;）和波形纤维蛋白（1：200）孵育过夜。同1：200稀释的二抗共孵育后，用含DAPI的荧光盖玻片盖住切片，并在Axioplan 2显微镜下进行检查。

阴性对照样品仅发出最小的自身荧光信号。 每只动物至少分析四个组织切片（技术重复）。 对于每次图像采集，所有成像参数均相同。

结果：mNGF和TrkA表达：在视网膜中，mNGF及其受体TrkA支持视网膜神经节细胞和感光细胞的存活，维持视网膜的发育和体内稳态。为了解不同年龄OXYS和Wistar大鼠视网膜NGF是否受到影响，用特异性抗NGF抗体和抗TrkA抗体对其进行了连续组织切片观察。视网膜切片免疫组化染色结果分析表明，NGF和TrkA蛋白主要集中在不同年龄和不同品系大鼠的神经节细胞层（GCL）中。我们没有检测到OXYS和Wistar大鼠在20周龄或3月龄时NGF和TrkA蛋白表达的变化。3月龄Wistar大鼠GCL和视网膜内核层（INL）可见NGF和TrkA蛋白染色，OXYS大鼠则可见NGF和TrkA蛋白位于GCL。随着月龄的增加，大鼠视网膜NGF和TrkA蛋白在GCL中的共定位随年龄增长而增加。OXYS和Wistar大鼠视网膜NGF和TrkA随年龄增长而增加。到18个月龄时，OXYS大鼠视网膜中NGF和TrkA含量增加，除感光层和RPE外，视网膜各层均可见NGF和TrkA蛋白。相反，在Wistar视网膜中，在GCL中可检测到NGF染色，而在GCL和INL中可检测到TrkA表达，但与3个月龄和年龄匹配的OXYS大鼠相比，蛋白NGF和TrkA的共定位降低。

在类AMD视网膜病变的衰老和发展过程中，大鼠视网膜中的NGF和TrkA表达。 在不同年龄的OXYS和Wistar大鼠（n = 4）的视网膜中mNGF（红色）和TrkA（绿色）的双标记免疫荧光染色。18月龄OXYS和Wistar大鼠视网膜波形纤维蛋白（红色）和mNGF（绿色）的双标记免疫荧光染色。在AMD样视网膜病变的晚期，波形纤维蛋白表达增加。 在OXYS视网膜中，波形纤维蛋白和mNGF具有良好的共定位性。DAPI染色细胞核呈蓝色。缩写：GCL，神经节细胞层；INL，内核层；ONL，外核层

mBDNF和TrkB表达

近年来，BDNF在视网膜病理、神经保护和氧化应激中的作用已被广泛研究。尽管如此，大多数的研究都集中在BDNF-TrkB信号转导在青光眼、原发性开角型青光眼和糖尿病视网膜病变中的作用，但是在AMD的发展过程中proBDNF和mBDNF表达水平和模式的变化还不清楚。为了评估mBDNF和TrkB在大鼠视网膜衰老和视网膜病变发展过程中的功能，我们进行了双标记免疫荧光。在GCL中观察到mBDNF染色，在20日龄Wistar大鼠的内丛状层中检测到TrkB信号，而在该年龄的OXYS大鼠中，在GCL和INL中检测到mBDNF蛋白，而在GCL中检测到TrkB。在OXYS和Wistar品系的视网膜中未观察到mBDNF和TrkB蛋白的共定位。 Wistar大鼠视网膜mBDNF和TrkB的含量及其共定位随年龄增长而增加，并逐渐高于OXYS大鼠。mBDNF的免疫荧光集中在GCL中，而在这两个品系的3和18月龄大鼠的GCL和INL中检测到TrkB信号。与年龄匹配的OXYS大鼠相比，在3月龄的Wistar大鼠的视网膜mBDNF和TrkB蛋白的共定位增加。 我们没有观察到在这个年龄的OXYS和Wistar大鼠之间mBDNF和TrkB蛋白的表达和共定位的差异。

在类似AMD的视网膜病的衰老和发展过程中，大鼠视网膜中的mBDNF和TrkB表达。a在不同年龄的OXYS和Wistar大鼠（n = 4）的视网膜中mBDNF（绿色）和TrkB（红色）的双标记免疫荧光染色. b 3月龄的OXYS和Wistar大鼠视网膜中NeuN（绿色）和mBDNF（红色）的双标记免疫荧光染色。OXYS大鼠视网膜神经节细胞无mBDNF表达。3月龄OXYS和Wistar大鼠视网膜波形纤维蛋白（红色）和mBDNF（绿色）的双标记免疫荧光染色。OXYS和Wistar大鼠视网膜的Muller胶质细胞均表达mBDNF。用DAPI染色细胞核呈蓝色。缩写：GCL，神经节细胞层；INL，内核层；ONL，外核层

尽管在OXYS大鼠的类AMD视网膜病变发展过程中仅观察到mBDNF和TrkB染色的细微变化，，但OXYS大鼠和Wistar大鼠mBDNF的细胞类型特异性表达存在差异。

proBDNF和p75NTR表达：

我们研究了OXYS和Wistar大鼠在AMD样视网膜病变发生过程中proBDNF及其受体p75NTR的免疫标记。视网膜冷冻切片的免疫染色显示proBDNF和p75NTR仅存在于GCL，INL和外丛状层（OPL）中。我们没有检测到OXYS和Wistar大鼠在20日龄时proBDNF和p75NTR蛋白的标记差异，但是OXYS大鼠中这些蛋白的共定位程度高于Wistar大鼠。这个结果可能意味着20日龄的OXYS大鼠视网膜细胞死亡增加。事实上，与年龄相仿的Wistar大鼠相比，OXYS大鼠在20 日龄时细胞凋亡增加。随着年龄的增长，Wistar大鼠中proBDNF和p75NTR的含量及其共定位降低。与Wistar大鼠相比，在3月龄OXYS大鼠，在GCL，INL和OPL中观察到proBDNF标记增加。18月龄OXYS大鼠的视网膜中proBDNF标记增加，在GCL中proBDNF及其受体p75NTR的共定位增加。观察到老年OXYS大鼠视网膜中proBDNF和p75NTR的共定位增加，并且这种改变伴随着外核层中感光细胞的数量减少以及外层神经节神经元数量的减少。最近的研究指出，在OXYS大鼠视网膜病变的晚期，细胞凋亡的作用不大，并且在AMD期间优先参与视网膜的其他类型的细胞死亡（如自噬和坏死）。

在类AMD视网膜病变的衰老和发展过程中，大鼠视网膜中的proBDNF，mBDNF和p75NTR表达。a、OXYS和Wistar大鼠（n = 4）的视网膜中proBDNF（红色）和p75NTR（绿色）的双标记免疫荧光染色。B、使用针对proBDNF（红色）和mBDNF（绿色）的抗体对OXYS和Wistar大鼠视网膜的冷冻切片进行染色。与Wistar大鼠相比，OXYS大鼠各年龄段proBDNF均高于mBDNF。缩写：GCL，神经节细胞层；INL，内核层；ONL，外核层

结论：尽管许多研究报告表明，对眼进行局部NGF和/或BDNF治疗可能是AMD的潜在有效疗法，但仍难以将其应用于临床。需要收集更多转化和临床数据，以便在现实生活中重现这些发现。我们的数据表明，人类年龄相关性视网膜改变的广谱性和AMD风险的差异可能归因于遗传差异和免疫系统因素的不同。综上所述，这些数据表明视网膜神经营养因子平衡的改变与OXYS大鼠AMD样视网膜病变的发生有关，并证实它们参与了人类AMD的发病机制。这项研究进一步认识到，Muller细胞通过产生神经营养素或促进其运输，在维持和支持其他视网膜细胞类型方面的重要性。

原文出自：https://link.springer.com/article/10.1186/s12920-019-0493-8