摘要：暴露于外源化合物的敏感性是可变的。 导致这一现象的一个可能因素是微生物组，它涵盖了所有微生物，其编码的基因以及在宿主生物中定植的相关功能。微生物群具有影响外源化合物暴露的毒物动力学的能力。肠道微生物可通过微生物-肠-脑轴来改变环境化学物质的神经毒性作用。这是肠道微生物与宿主神经系统之间的复杂双向信号传导途径。作为模型生物，斑马鱼可以很好地阐明微生物群改变环境化学物质对发育神经毒性的机制。这篇综述文章的目的是在毒理学背景下检查微生物-肠-脑轴，特别是着眼于斑马鱼模型的优缺点，以研究外源化合物制剂与宿主相关微生物之间的相互作用。先前的研究将讨论肠道微生物与宿主神经发育之间的关系。从神经毒理学的角度，强调了利用斑马鱼评估神经毒理学结果与微生物组之间联系的研究。在这篇综述中，我们证明了斑马鱼是研究化学暴露，微生物和宿主神经毒理学结果之间复杂关系的理想模型系统。

关键词： 微生物 斑马鱼  发育神经毒性

斑马鱼作为神经毒理学研究的公认模型：

斑马鱼是一种非哺乳动物的脊椎动物模型，已被很好地确立为神经毒理学研究的替代模型。斑马鱼基因组完全测序，其约70–80％基因与人类对应基因同源。与常用的动物模型（如小鼠和大鼠）相反，斑马鱼的胚胎在母亲外部发育，因此发育中的胚胎可以直接暴露于异源物质。斑马鱼的器官发生在受精后72小时内完成，胚胎和仔鱼都可以在96个孔板中进行毒理学评估，或者在早期发育分析中，在384个孔板中可以很容易地进行化学暴露。与人类相比，斑马鱼的神经发育通常是保守的。6hpf时，在原肠胚形成过程中，外胚层开始分化。类似于其他哺乳动物物种，斑马鱼神经外胚层发展成神经板并进行神经处理（即将神经板折叠成神经管的过程）。然而，与大多数脊椎动物相比，斑马鱼的神经形成是通过不同的过程发生的。在斑马鱼中，大约12 hpf时，神经板形成神经龙骨，导致形成神经棒，然后形成神经管。前脑，中脑（视神经顶盖，下丘脑），后脑（小脑延髓）和脊髓在16 hpf时可见。受精后2-3天，包括γ-氨基丁酸能神经元、儿茶酚胺能神经元、5-羟色胺能神经元和去甲肾上腺素能神经元在内的神经元亚型开始分化。与哺乳动物相似，斑马鱼也含有星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞、小脑浦肯野细胞、髓鞘和运动神经元，3dpf斑马鱼形成功能性血脑屏障（BBB）。神经毒性表现包括脑室的丢失或扩张，端脑的截断和神经元坏死。斑马鱼胚胎和幼体的自动行为测试被广泛用作暴露于环境化学物质的动物神经发育的功能读数。外源化合物的神经毒理学作用也通常使用老年斑马鱼进行评估。根据饲养温度的不同，可以评估胚胎暴露于外源化合物对自发活动（即头和尾的卷曲）的影响，这种活动最早开始于17 hpf。可以根据行进距离、活动时间或对光照等刺激的行为反应模式对斑马鱼幼鱼的行为进行分析。此外，还可以评估幼虫行为，例如避免威胁，通过趋触性测量的焦虑样行为以及光动力反应。适应性，最原始的学习形式，，也可以使用自动跟踪系统和重复的声音惊吓在斑马鱼的幼虫中进行测试。还通常评估成斑马鱼的神经行为以研究基线运动能力，焦虑样行为，习惯和记忆，同伴识别和厌恶刺激识别。对于所有的胚胎、幼虫和成人行为测试，缺乏标准化的测试程序。

图1.使用斑马鱼定植系统测试微生物群是否会影响接触环境化学物质的斑马鱼神经发育毒性。

除了形态学和行为学终点外，分子生物学方法还广泛用于检查斑马鱼的神经毒性结果。靶向基因表达或微阵列已被无偏RNA测序所取代。除非测序方法应用于从转基因株系中分离出的特定细胞类型，否则这些方法通常缺乏空间信息。原位杂交在斑马鱼中的应用已经很长时间了，它揭示了发育中神经系统中的时空基因表达。从神经毒性的角度来看，外源诱导的基因表达变化最适合用于假设的产生，可以通过增加或减少功能实验进行经验测试。吗啉反义寡核苷酸几乎被普遍用于研究神经毒理作用机制。然而，由于对非靶向效应的关注，在毒理学背景下用于机制描述的新兴金标准是基因编辑，通常通过CRISPR技术进行，尽管该方法还引入了非靶向突变。最后，开发了能够实时显示和量化斑马鱼体内电活性的转基因系，并将其用于评估外源化合物的神经毒性。总的来说，有大量的工具和方法可以进行危险识别和机制研究，以检查外源化合物暴露的神经毒理学影响。

斑马鱼作为一种新兴的微生物-肠-脑轴研究模型

微生物-肠-脑轴描述了位于胃肠道（GI）的微生物与宿主中枢神经系统（CNS）之间的复杂双向通路。该轴监测并整合肠道功能，将大脑中的情感和认知中心与肠道通透性、肠道反射、肠道内分泌信号和免疫激活联系起来。通过迷走神经神经元与肠上皮细胞形成突触来实现双向交流， 通过微生物产物的产生或对宿主细胞因子和趋化因子进行微生物刺激，穿透血脑屏障并对宿主神经系统产生直接影响。宿主下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA）协调对环境化学物质等应激源的适应性反应，升高全身促炎细胞因子，在微生物群-肠-脑轴中也起重要作用。迷走神经通路和HPA通路之间的通讯可以调节肠道效应细胞的活动，例如上皮细胞，平滑肌细胞，间质细胞和肠嗜铬细胞，以及肠神经元，它们也可能受到肠道微生物群的影响。这些细胞对肠道微生物合成和/或代谢的一系列分子有反应，这些分子包括儿茶酚胺，GABA，胆汁酸和短链脂肪酸（SCFA）。一种众所周知的宿主微生物相互作用与神经递质5-羟色胺有关，其中90%以上是通过肠嗜铬细胞中的微生物依赖性合成在肠道中产生的。

图2 微生物-肠-脑轴。该轴允许肠道微生物群和宿主神经系统之间进行双向通路。该途径的关键要素包括迷走神经，下丘脑-垂体-肾上腺轴和胆汁酸的微生物产生，神经活性饮食代谢物和神经递质，以及微生物刺激神经活性宿主衍生的细胞因子。通常使用斑马鱼，小鼠，大鼠，苍蝇和线虫等动物模型来研究微生物肠-脑轴。

图3 常用微生物研究动物模型的优缺点。

在斑马鱼和哺乳动物中，随着微生物的成熟，微生物群落变得更加成熟和多样化。 在门类水平上，斑马鱼的微生物群会根据实验室环境而变化，并且通常以变形菌门，厚壁菌门和梭杆菌门为主导。相比之下，小鼠和人类的微生物群主要是厚壁菌门和拟杆菌门。人类也含有相当数量的属于放线杆菌门的细菌。而物种间微生物群组成的某些差异可归因于环境因素如温度、饮食或盐度，宿主因素也强烈影响每个物种内微生物群落的发育和成熟。例如，对斑马鱼的一些研究表明，微生物组成受肠道中宿主特异性选择压力的影响，即使在饮食和环境等外部因素保持不变的情况下，微生物的组成也会改变。此外，移植了小鼠肠道菌群（主要是厚壁菌）的无菌成年斑马鱼，形成了类似于传统斑马鱼肠道（主要是蛋白质细菌）的微生物群，而不是传统的小鼠肠道。当斑马鱼微生物群移植到无菌小鼠体内时，也出现了类似的现象，这表明斑马鱼和哺乳动物模型中都存在类似的宿主选择因子和信号机制。重要的是，与哺乳动物相比，斑马鱼体内适度多样化的微生物群含有功能相似的酶和生化途径。在研究设计方面，面向微生物群的研究的替代模型（如果蝇、线虫和斑马鱼）的优势之一是能够轻松地产生和维持这些生物体的多种定植状态，包括常规定植。相对于果蝇和秀丽隐杆线虫等较不复杂的系统，斑马鱼具有特别的优势，因为它与人/哺乳动物基因组的遗传相似性更高，微生物多样性更高，并且存在更复杂的测定方法来研究微生物-肠道-大脑的相互作用。因此，斑马鱼代表了一个理想的中间模型系统，具有足够的微生物群复杂性，但也允许相对简单的修改微生物定植状态。但是，不应忽略斑马鱼模型相对于小鼠和人类的上述重要缺点（例如胃肠道结构和微生物群组成），因为物种之间的关键差异可能会影响与外源化合物剂的毒代动力学。总体而言，轻松操纵幼虫定植状态的能力是一项关键的技术优势，可用于确定微生物定植状态是否影响暴露于环境化学物质的发育神经毒性。需要更多的工作来了解在外源化合物暴露的情况下宿主相关微生物的结构和潜在功能差异如何影响微生物群与大脑的相互作用。

斑马鱼微生物-肠-脑轴行为学研究

如前所述，斑马鱼的行为通常被用作神经发育的功能读取。同样的逻辑也可以用来评估斑马鱼微生物-肠-脑轴。在斑马鱼幼虫中，微生物群可以调节运动和焦虑相关行为。 Davis等人研究结果显示，与定植对照相比，无菌斑马鱼是高度活跃的。趋触性是一种对多壁板边缘的偏好，被用作衡量斑马鱼焦虑样行为的功能指标。 无菌斑马鱼在趋触性试验中表现出焦虑样行为减少，尽管这一发现在后来的研究中没有重复。缺乏一个标准化的方法来评估斑马鱼的趋触性可能解释了不一致的数据。这支持以下概念：神经系统发育的关键窗口需要微生物定植，以使斑马鱼能够进行类似控制的发育，并且在这些暂时不同的窗口关闭后进行常规操作可能不足以恢复类似控制的行为。哺乳动物的数据证实了这一点：断奶后无菌小鼠的定植不能补充中枢神经系统中降低的血清素水平。换句话说，在老鼠身上，有一个严格的发育窗口，需要微生物定植来控制，比如建立血清能信号。尽管取得了这些进步，但微生物定植影响控制斑马鱼定型行为（即幼体游泳反应和趋触性）的回路的发育和功能的机制以及这些微生物组与宿主之间的相互作用如何受外源化合物的影响尚不清楚。在成年斑马鱼中，两项独立的研究同样利用行为来观察益生菌对宿主神经系统的影响。在新型水箱试验中，向成年斑马鱼补充植物乳杆菌（未指定菌株）一个月后，可微妙地改变肠道菌群，并导致类似焦虑的行为显著减少。

微生物与外源化合物相互作用的框架

人们越来越了解微生物群与外源化合物试剂相互作用以影响宿主毒性（例如神经发育毒性）的机制。从理论上讲，可以通过毒理动力学相互作用而发生，其中化学暴露会导致营养不良，其特征是宿主相关微生物群落结构发生变化，进而影响宿主。化学选择的微生物群也可以进行化学激活或解毒反应（即毒代动力学相互作用）。幼虫或成年斑马鱼的许多研究表明，该模型系统可用于描述暴露于药物或环境化学物质后的失调。在斑马鱼模型中获得的最新证据还证明了化学物质与微生物群之间的毒代动力学相互作用，其中肠道微生物对外源化合物进行生物激活或解毒。

图4. 微生物与外源化合物相互作用的框架。

外源化合物暴露会改变宿主相关微生物的群落结构

斑马鱼的化学诱导失调的鉴定是最近的一个综述的主题，这里将不详细讨论。斑马鱼暴露于多种异源生物制剂已显示出破坏与宿主相关的微生物（包括农药，金属，微塑料和抗生素）的群落结构。我们将讨论一致和不一致结构数据的一个关键理论和实例，而不是列出各种外来生物暴露后特定分类群的定性变化。

首先，最近的一项研究比较了6种浓度的增塑剂双酚A（BPA）或4种替代化学品（BPAF、BPB、BPF或BPS）对斑马鱼群落结构和发育毒性的影响。并非所有测试的化合物都会影响微生物结构（如BPAF或BPB）。有趣的是，异源化合物重组微生物群的能力与其对发育毒性的效力成反比。这说明了一个原理，即化合物可能不会导致微生物群失调，仅仅是因为扰乱群落结构所需的浓度不能被宿主所容忍。相反，宿主耐受良好的化合物可能更容易引起微生物群结构失调。由于斑马鱼发育毒性试验被广泛用于危害识别和化学优先排序，这些数据表明，具有较低宿主毒性特征的化学品更可能同时导致宿主相关微生物的失调。暴露于相同化学试剂后的结构数据可能不一致，因为微生物群受到外部因素的显著影响，这些因素包括饮食，遗传，年龄或水质参数，这些参数通常在实验室之间存在很大差异。总体而言，虽然这些研究报告了化学依赖性微生物群失调，但大多数研究未能将群落结构的变化与宿主的不利生理结果（即毒理相互作用）联系起来，这种不确定性是斑马鱼和其他模型系统中报告的外源诱导的结构失调的一个关键限制。

斑马鱼肠道菌群对外源物质的化学生物转化

肠道微生物群进行多种反应，以有效地从其环境中获取营养。微生物酶也能对异源物质进行生物转化。虽然越来越多的研究表明化学物质对斑马鱼微生物组的毒性作用，但这个模型中的毒代动力学数据相当有限。Catron等人结果表明，在10 dpf时，与定植斑马鱼相比，无菌斑马鱼体内雌二醇和一些直接雌二醇代谢产物的含量高出3倍，表明该系统中的微生物影响雌二醇代谢，并与宿主发生毒代动力学相互作用。最近的另一篇论文表明，定植的斑马鱼与亲本斑马鱼相比，其母体三氯生的浓度高2.5-3倍。总之，这些研究表明，定植状态影响斑马鱼的化学代谢，并且异源化合物的生物转化特征可能是化学特异性的。

利用斑马鱼研究微生物群对环境化学物质发育神经毒性的影响

斑马鱼是评估微生物群作为环境化学物质发育神经毒性修饰因子的出色模型。这很大程度上是由于三个关键因素。 一是因为斑马鱼在母亲外部发育，研究人员可以将发育中的胚胎直接暴露于异源化合物中。第二，由于这种生物最初是在一个无细胞的绒毛膜内发育的，因此产生无菌斑马鱼相对简单。第三，无菌斑马鱼和定植斑马鱼暴露在化学物质中，可以通过一系列自动化的行为分析来评估其发育神经毒性。抗生素治疗通常用于扰乱微生物群。为了支持斑马鱼神经行为发育的微生物联系，常规饲养的斑马鱼经广谱抗生素处理后表现出多动症。这一结果与哺乳动物的数据一致，哺乳动物的数据显示，在接触抗生素的小鼠中，多动症和焦虑样行为增加。

结论：

解构肠道微生物对环境化学物质神经毒性的影响是一个令人兴奋的新兴研究领域。斑马鱼是一个很好的模型，可用来揭示异源化合物，微生物群和宿主神经系统之间的复杂关系。在这一研究领域，该模型的主要优点是能够直接将定植的和无菌的斑马鱼暴露在环境化学物质中，然后使用多方面的自主行为表型评估发育中神经系统的全部复杂性。但是，不应忽视该模型的主要局限性。斑马鱼缺乏主要的胃肠道器官，如胃和淋巴结，这些器官会影响它们对外源性化合物的反应，特别是在微生物-肠-脑轴的情况下。需要更多的工作来了解分类学中的成分差异是否会导致异源化合物的毒代动力学改变，这些改变在宿主生理学水平上很重要。

原文出自：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0161813X19301354