摘要：SARS-COV-2已成为一种新的公共卫生威胁。 本文中，我们报道了FDA批准的药物金诺芬在低微摩尔浓度下能抑制SARS-COV-2在人细胞中的复制。用金诺芬处理细胞，在感染后48小时病毒RNA减少95%。Auranofin能显著降低SARS-COV-2诱导的细胞因子在人细胞中的表达。这些数据表明，金诺芬因其抗病毒，抗炎和抗活性氧（ROS）的特性，可能成为限制SARS-CoV-2感染和相关肺损伤的有用药物。有必要进行进一步的动物研究，以评估金诺芬治疗SARS-COV-2相关疾病的安全性和有效性。

关键词：SARS-COV-2  COVID-19  金诺芬  抗病毒  抗炎

摘要：金基化合物对多种临床条件和微生物感染显示出良好活性。自1985年以来， 金诺芬是一种含金的三乙基膦，是FDA批准的用于治疗类风湿关节炎的药物。已经对金诺芬在许多其他疾病中的潜在治疗应用进行了研究，这些疾病包括癌症，神经退行性疾病，HIV / AIDS，寄生虫感染和细菌感染。金诺芬被FDA批准用于癌症治疗的II期临床试验。口服金诺芬可有效治疗各种寄生虫感染的啮齿动物模型。一项临床前研究表明，金诺芬联合抗逆转录病毒治疗能显著降低HIV病毒载量。正在进行中的一项临床试验，利用金诺芬在影响氧化还原敏感细胞死亡途径中的作用，开发金诺芬作为一种候选药物，以减少HIV感染患者的潜在病毒库。金诺芬的作用机制包括抑制氧化还原酶如硫氧还蛋白还原酶、诱导内质网应激和随后激活未折叠蛋白反应（UPR）。这些氧化还原酶的抑制导致细胞氧化应激和内源性凋亡。此外，金诺芬是一种抗炎药，可减少细胞因子的产生并刺激细胞介导的免疫。有报道称金诺芬通过抑制JAK1和STAT3的磷酸化来干扰白介素6（IL-6）信号传导。金诺芬对炎症途径和硫醇氧化还原酶的双重抑制作用使其成为肿瘤治疗和微生物感染治疗的一个有吸引力的候选药物。

冠状病毒是一类正义，单链RNA基因组的包膜病毒。SARS-CoV-2是COVID-19的致病因子，与严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV-1）密切相关。在冠状病毒感染过程中，内质网应激和UPR激活对病毒的复制和发病有重要作用。SARS-COV-1感染可增加ER蛋白折叠分子GRP78，GRP94和其他ER应激相关基因的表达，从而维持蛋白折叠。过度表达SARS-COV棘突蛋白和其他病毒蛋白的细胞表现出高水平激活的UPR。因此，金诺芬抑制氧化还原酶如硫氧还蛋白还原酶和诱导内质网应激可显著影响SARS-COV-2蛋白的合成。

此外，SARS-COV-2感染会引起急性炎症和嗜中性粒细胞增多，从而导致细胞因子风暴，并导致IL-6，TNF-α，单核细胞趋化蛋白（MCP-1）和活性氧（ROS）过度表达。严重的COVID-19疾病代表由细胞因子风暴引起的毁灭性炎性肺部疾病，与多种器官功能障碍相关，导致高死亡率。综上所述，这些研究表明金诺芬因其抗病毒，抗炎和抗ROS的特性，可以减轻SARS-COV-2感染和相关的肺损伤。

我们研究了金诺芬对SARS-CoV-2的抗病毒作用及其对病毒诱导的人细胞炎症的影响。我们以SARS-CoV-2感染Huh7细胞，感染复数（MOI）为1，持续2 h，然后加入4μM金诺芬。 DMSO（0.1％）用作对照。在本研究中，我们使用了Huh7细胞，因为这些细胞高度允许SARS-COV-2复制。 感染后24和48 h收集细胞培养上清液和细胞裂解物。用两个分别针对病毒N1基因和N2基因的引物，用RT-PCR法检测病毒RNA拷贝。在感染后24小时，与DMSO相比，用金诺芬处理细胞可使上清液中的病毒RNA减少70%。在48小时，与DMSO相比，上清液中的病毒RNA减少了85%。类似地，与DMSO处理的细胞相比，金诺芬处理的细胞在24 h时细胞内病毒RNA的水平降低了24％，在48 h时降低了95％。两组的引物相同。 接下来，我们通过噬斑测定法测定了细胞培养上清液中的病毒滴度。 在感染后48 h，金诺芬处理显着降低了细胞培养上清液中的SARS-COV-2感染力效价。

图1.金诺芬抑制SARS-COV-2在人类细胞中的复制。 将Huh7细胞以1的感染复数（MOI）感染SARS-COV-2，持续2 h，然后用4μM的金诺芬或0.1％DMSO处理。感染后24和48h收集细胞沉淀和培养上清液，并使用引物和靶向SARS-COV-2 N1基因和SARS-COV-2 N2基因的探针通过RT-PCR测量病毒RNA水平。对从感染细胞中提取的细胞RNA进行定量，标准化并计算每微克总细胞RNA的病毒RNA水平。两组引物的结果均相同，在24和48h时病毒RNA均显著降低。 在感染后48 h，通过噬菌斑测定法测量细胞培养上清液中的SARS-COV-2感染滴度。

为了确定抑制50％病毒复制的金诺芬的有效浓度（EC50），我们用金诺芬的系列稀释液处理了SARS-COV-2感染的Huh7细胞。感染后48h收集上清液和细胞裂解液，并通过RT-PCR定量病毒RNA。 使用非线性回归模型（GraphPad软件）以图表形式绘制数据。在第48小时时，金诺芬处理过的细胞中病毒RNA水平呈剂量依赖性降低。图2显示了金诺芬治疗SARS-CoV-2感染Huh7细胞的EC50值。金诺芬抑制了感染细胞中病毒复制，EC50约为1.4μM。值得注意的是，与最近发表的关于氯喹、羟基氯喹和瑞德西韦体外抗SARS-COV-2病毒活性的报告相比，本研究使用了20-100倍的病毒剂量（MOI为1）感染细胞。

图2 金诺芬处理细胞中SARS-COV-2RNA的剂量依赖性减少：用金诺芬（0.1-10μM）连续稀释处理SARS-COV-2感染的Huh7细胞。使用引物和靶向SARS-COV-2 N1的探针通过RT-PCR对细胞沉淀和培养上清液中的病毒RNA进行定量。使用非线性回归模型（GraphPad软件）以图表形式绘制数据。金诺芬抑制了感染细胞中病毒复制，EC50约为1.4μM。50%的细胞毒性浓度约为5.7μM。数据代表重复进行的两个独立实验。

为了评估金诺芬对SARS-COV-2感染期间炎症反应的影响，我们在感染后24和48 h测量了金诺芬和DMSO处理的细胞中的关键细胞因子水平。SARS-COV-2感染可诱导Huh7细胞中IL-6，IL-1β，TNFα和NF-kB的表达上调。用金诺芬治疗显著降低Huh7细胞中SARS-COV-2诱导的细胞因子的表达。与相应的模拟感染细胞相比，SARS-COV-2感染在感染后48h导致IL-6 mRNA表达增加200倍。相反，金诺芬处理的细胞中IL-6表达仅增加2倍。感染后48小时，DMSO处理的细胞中TNF-α水平增加了90倍，但金诺芬处理的细胞中没有这种增加。类似地，在金诺芬处理的细胞中未观察到IL-1β和NF-kB表达的增加。

图3.金诺芬治疗显著降低了SARS-COV-2诱导的人细胞因子的表达：用qRT-PCR法检测感染后24和48小时IL-6、IL-1β、TNFα和NF-kB的mRNA水平。

结果表明金诺芬以低的微摩尔浓度抑制SARS-COV-2在人细胞中的复制。金诺芬治疗可显著降低病毒感染诱导的细胞因子表达。数据表明金诺芬可能是一种有效的抑制SARS-CoV-2感染和相关肺损伤的药物。进一步的动物研究有助于评价金诺芬治疗SARS-COV-2相关疾病的安全性和有效性。

原文出自：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0042682220300817