摘要：自2019年12月以来，新型冠状病毒SARS-CoV-2出现并迅速传播到世界各地，导致全球公共卫生突发事件。由于缺乏疫苗和抗病毒药物，迫切需要动物模型。人血管紧张素转化酶II（ACE2）已被确定为SARS-CoV-2的功能受体。 在这项研究中，我们使用CRISPR / Cas9敲入技术生成了表达人ACE2（hACE2）的小鼠模型。与野生型C57BL/6小鼠相比，青年和老年hACE2小鼠经鼻感染后，在肺、气管和脑中均能维持较高的病毒载量。尽管未观察到死亡，但在感染SARS-CoV-2的老年hACE2小鼠中发现间质性肺炎和细胞因子升高。有趣的是，已证明在胃内接种SARS-CoV-2会导致生产性感染并导致hACE2小鼠发生肺部病理变化。该动物模型为研究SARS-CoV-2的传播和发病机制，评价COVID-19疫苗和治疗方法提供了有用的工具。

关键词：SARS-CoV-2  小鼠模型  血管紧张素转换酶II  发病机制

简介：与其他CoV一样，SARS-CoV-2的基因组RNA编码非结构性复制酶多蛋白和结构蛋白，包括棘突（S），包膜（E），膜（M）和核衣壳（N）蛋白。CoVs的S蛋白构成病毒表面的棘突，在病毒结合、融合、进入以及诱导中和抗体和T细胞反应中起重要作用。更重要的是，一些开创性的研究表明，SARS-CoV-2和SARS-CoV都利用相同的细胞受体人血管紧张素转换酶2（hACE2）进入细胞。与hACE2结合的SARS-CoV-2s蛋白受体结合域（RBD）的晶体结构已被解析，其对hACE2的亲和力比SARS-CoV高10～20倍。这些发现为针对RBD / hACE2相互作用的有效干预策略铺平了道路。已证明外源性hACE2可以抑制细胞培养物中的SARS-CoV-2感染，并且正在使用体外培养物测试几种靶向SARS-CoV或SARS-CoV-2的RBD的单克隆抗体。目前，尚未在动物模型中对疫苗或抗病毒药物进行有效测试，因此.迫切需要复制COVID-19患者的临床过程和病理学的小动物模型。在本研究中，我们使用CRISPR/Cas9敲入技术，以人ACE2替代内源性小鼠ACE2，生成了稳定的人源化ACE2小鼠。进一步的特征表明，这些人源化的小鼠通过鼻内接种极易感染SARS-CoV-2，SARS-CoV-2感染动物的病毒动力学和病理结果再现了COVID-19患者的主要发现。此外，人源化ACE2小鼠经胃注射SARS-CoV-2也可引起感染和肺损伤。这种独特的小鼠模型为研究SARS-CoV-2的感染和传播，以及评价SARS-CoV-2疫苗和治疗方法提供了有用的工具。

结果：使用CRISPR / Cas9建立了hACE2人源化小鼠

先前的研究表明，表达人ACE2的转基因小鼠对极易感染SARS-CoV。。 在这里，我们旨在使用CRISPR / Cas9敲入技术建立人源化ACE2小鼠。将hACE2的完整cDNA插入位于X染色体GRC m38.p6位点的mAce2基因的外显子2中，第一个编码外显子。这扰乱了mAce2基因并终止了它的表达。将tdTomato基因插入到hAce2的下游，内部核糖体进入位点（IRES）。允许hACE2和tdTomato共表达。添加了土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件（WPRE）和poly（A）序列，以增强mRNA的稳定性和翻译效率。这种靶向策略允许在mAce2启动子控制下hACE2的内在表达。将靶向构建体连同亚基因组RNA（sgRNA）和Cas9 mRNA一起注入C57BL / 6小鼠的370个受精卵。通过PCR筛选确认46个后代中有10个（21.74％）成功插入，然后将三个成功插入鼠与C57BL / 6小鼠回交，并筛选了37个F1阳性后代。通过测序和Southern印迹进一步证实了12只F1阳性小鼠的靶向结果。正如预期的那样，WPRE内部探针显示没有动物随机插入。重要的是，western blotting结果显示hACE2在肺和肾中表达较强，而在脾脏和肝脏中表达较弱，在野生型（WT）动物中表现出类似的mACE2蛋白表达模式。更重要的是，纯合子hACE2小鼠的mAce2基因未被PCR检测到，杂合子小鼠的mAce2基因表达显著下降，而hACE2杂合子小鼠和纯合子小鼠的肺、小肠、脾脏和肾脏中均检测到hACE2基因的显著表达，而WT小鼠则没有。利用共表达设计，通过生物发光成像对hACE2小鼠的整体表达模式进行了观察。此外，对纯合小鼠肺部的免疫荧光染色显示，hACE2和tdTomato主要在气道的CC10 + Clara细胞和少量表面活性蛋白C阳性的肺泡II型细胞中表达。因此，我们建立了在mACE2启动子控制下稳定表达hACE2的纯合子小鼠模型，因此将其称为hACE2-KI / NIFDC小鼠（缩写为hACE2小鼠）。

hACE2小鼠经鼻途径极易感染SARS-CoV-2：

为进一步了解hACE2小鼠对SARS-CoV-2感染的易感性，将青年（4.5周龄）和老年（30周龄）hACE2小鼠分别用4×105pfu 的SARS-CoV-2经鼻感染，并设野生型（WT）C57BL/6小鼠作为对照。每天监测所有动物的临床症状和体重变化，并在感染后第6天处死（dpi）。接种的动物没有出现明显的临床症状，只有老年的hACE2小鼠在3dpi时体重下降了10%，然后恢复。在青年和老年hACE2小鼠的肺、气管和脑组织中都发现了大量的病毒RNA复制，而在脾、肾、肝、肠和血清中没有发现病毒RNA。特别是用菌斑法成功地从肺标本中检测出传染性SARS-CoV-2。正如预期的那样，在WT C57BL/6小鼠的任何受试组织或血清中均未检测到病毒RNA。有趣的是，我们还在老年hACE2小鼠粪便中检测到高水平的病毒RNA（2.9×10⁵拷贝/g）。为了确认模型中SARS-CoV-2的主要靶细胞，我们进一步用不同的细胞标记物对感染的hACE2小鼠的肺部进行了染色，其中包括Clara细胞（以Clara细胞10 kDa蛋白/ CC10标记），纤毛细胞（ 以β-IV-微管蛋白标记），1型肺泡细胞（AT1，以podoplanin / PDPN标记）和2型肺泡细胞（AT2，以表面活性剂蛋白C / SPC标记），以及病毒S蛋白和hACE2。SARS-CoV-2 S蛋白主要与CC10和hACE2共定位，表明CC10阳性Clara细胞是SARS-CoV-2在气道中的主要靶细胞。此外，对hACE2感染小鼠脑切片的免疫染色显示，在神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中也能检测到病毒S蛋白的表达。总之，这些结果表明，与WT小鼠相比，hACE2小鼠对经鼻SARS-CoV-2感染高度敏感，在肺Clara细胞以及气管和大脑中具有持续的强病毒RNA复制。

hACE2小鼠感染SARS-CoV-2后发展为间质性肺炎：

为检测SARS-CoV-2感染的hACE2小鼠是否具有与COVID-19相似的病理特征，对SARS-CoV-2感染动物的肺组织进行了组织病理学检查、免疫组化和免疫荧光染色。与SARS-CoV-2感染的WT小鼠相比，H&E染色显示青年和老年hACE2小鼠均发生了间质性肺炎，表现为炎性细胞浸润、肺泡间隔增厚和明显的血管系统损伤。在老年小鼠中观察到更多的肺泡上皮细胞病变和局灶性出血。IHC染色结果显示，与WT小鼠相比，SARS-CoV-2感染可诱导老年hACE2小鼠中性粒细胞（Neu+）和巨噬细胞（CD68+）浸润。此外，免疫荧光共染色显示SARS-CoV-2直接感染了肺中CD68阳性的巨噬细胞，从而导致了hACE2老年小鼠的细胞凋亡显著（C-Casp3 +）。Luminex细胞因子分析表明，SARS-CoV-2感染导致老年hACE2小鼠细胞因子产生增加，包括嗜酸细胞活化趋化因子，G-CSF，IFN-γ，IL-9和MIP-1β，但在青年小鼠感染后产生的反应较弱。因此，hACE2小鼠不仅持续病毒复制，而且在SARS-CoV-2感染后也出现了肺部病理。

通过胃内途径接种SARS-CoV-2建立了hACE2小鼠的生产性感染：

SARS-CoV-2主要通过飞沫和人与人之间的密切接触传播。然而，部分COVID-19感染者有腹泻、腹痛、呕吐等胃肠道症状，在COVID-19患者粪便中检测到病毒RNA，提示SARS-CoV-2可能通过粪便经口传播。在此，我们试图研究SARS-CoV-2是否可以通过胃内途径在hACE2小鼠中建立生产性感染。在SARS-CoV-2灌胃后，所有动物均接受5dpi的日常监测和组织处理。3只灌胃接种SARS-CoV-2的hACE2小鼠均未见临床症状，但2只小鼠气管（2.9×10⁶拷贝/g）和肺（3.2×10⁶拷贝/g）均检测到高水平的病毒RNA，与经鼻途径感染的动物相当。重要的是，在感染的hACE2小鼠的肺气道中也检测到SARS-CoV-2 S蛋白的表达。此外，在感染了SARS-CoV-2的hACE2小鼠中观察到间质性炎症，肺泡间隔增厚。结果表明，在hACE2小鼠胃内接种SARS-CoV-2也可以建立生产性感染，并导致肺部病理改变。

讨论：在本研究中，我们生成了稳定的人源化小鼠品系，其中与tdTomato报告基因融合，hACE2的表达受IRES的控制。 进一步的特征表明，纯合小鼠中mACE2的表达完全被hACE2取代，在肺和小肠中的hACE2表达达到峰值。以前，已经用不同的策略产生了数种hACE2转基因小鼠，并用于模拟SARS-CoV感染。通常，在转基因小鼠中由SARS-CoV引起的肺部病理与肺hACE2表达水平相关。因此，研究了这种转基因小鼠以模仿SARS-CoV-2感染。与这种转基因小鼠模型相比，我们的hACE2小鼠模型具有多个优势。 首先，将hAce2基因插入X染色体上的GRC m38.p6位点以取代mAce2，并且在纯合hACE2小鼠中没有内源性mACE2表达。由于转基因插入是随机发生的，因此着陆基因的完整性可能会受到影响。其次，我们的小鼠模型中hACE2的组织分布与COVID-19患者的临床表现相符，并且在肺中检测到高水平的hACE2表达。有趣的是，最近基于人类组织单细胞测序结果的分析表明，肾脏、心脏、食道、膀胱和回肠也代表高丰度组织，而肝脏、脾脏、小肠、卵巢和大脑是我们模型中富含hACE2的组织。人与小鼠之间的这种不一致值得进一步研究。第三，tdTomato基因的引入可以实时监测hACE2的表达。所有这些理想的生理特性以及hACE2小鼠稳定的遗传和表型促使我们测试它们在SARS-CoV-2感染复制中的应用。我们对SARS-CoV-2的挑战性实验清楚地表明， hACE2小鼠对鼻内接种SARS-CoV-2感染高度敏感，并且4×105 pfu的 SARS-CoV-2很容易导致呼吸道（肺和气管）以及大脑中的病毒复制。肺内病毒RNA载量达108拷贝/g，明显高于hACE2转基因小鼠。由于很少有COVID-19患者出现神经系统感染，因此大脑中病毒RNA的存在有些出乎意料。SARS-CoV感染的转基因模型也证实了病毒对大脑的趋化性，这与我们的发现是一致的。SARS-CoV或SARS-CoV-2侵入大脑的潜在机制以及与疾病严重程度的关系尚待确定。进一步表征表明，气道的CC10 + Clara细胞是我们模型中SARS-CoV-2的主要靶细胞。Clara细胞中的特定蛋白酶，例如类胰蛋白酶Clara，可能有助于S蛋白的有效切割，从而增强病毒进入细胞的能力。 此外，肺泡中的CD68 +巨噬细胞也被SARS-CoV-2感染，导致严重的细胞凋亡。有趣的是，大量不表达hACE2的细胞也感染了SARS-CoV-2。SARS-CoV-2如何侵入这些细胞也值得进一步研究。 总的来说，我们的结果提供了第一线证据，显示了小鼠肺中SARS-CoV-2的特定主要靶细胞。

最重要的是，所有经经鼻接种SARS-CoV-2的hACE2小鼠均发生了间质性肺炎，其特征在于炎症细胞浸润，肺泡间隔增厚和独特的血管系统损伤，从而概括了大多数COVID-19患者的临床特征。早期的流行病学发现表明，高龄会导致COVID-19患者的死亡率增加，而我们从hACE2模型获得的结果很好地反映了这一发现。年龄较大的hACE2小鼠（30周龄）在SARS-CoV-2感染后体重减轻，而年轻的hACE2小鼠（4.5周龄）和野生型小鼠在观察期内保持体重增加。值得注意的是，尽管青年小鼠和老年小鼠都在肺中维持相似的病毒复制，但在老年hACE2小鼠中观察到更严重的病理变化以及细胞因子反应的增强。

有几条证据支持SARS-CoV-2的潜在粪口传播。首先，在许多COVID-19患者中都出现了胃肠道症状，并且报道了粪便中有病毒脱落。其次，发现ACE2在胃肠道上皮细胞中高表达，体外研究也表明SARS-CoV-2可感染胃肠道多个细胞。第三，SARS和MERS的经验支持人类冠状病毒在粪便经口传播所必需的环境条件下维持其生存能力。最近从SARS-CoV-2获得的数据显示了与SARS-CoV相似的稳定性，表明相似的传播途径是可行的。我们从hACE2小鼠模型获得的结果提供了支持该假设的证据。由于设施的限制，我们无法收集和量化每只动物的粪便样本。重要的是，高水平病毒RNA和活性病毒蛋白的存在证明了胃内接种SARS-CoV-2在hACE2小鼠呼吸道中引起生产性感染。但是，我们的初步结果表明，SARS-CoV的胃内感染不如鼻内感染有效：胃内模型的激发剂量比鼻内模型高10倍，但是，仅在测试的3只动物中的一只发现了肺部感染。病毒RNA载量和蛋白表达也低于鼻内接种模型。在人类临床环境中是否确实发生了SARS-CoV-2的胃内感染尚待确认。SARS-CoV-2在胃肠道环境中存活并最终侵入我们的小鼠模型的呼吸道的潜在机制值得进一步研究。

结果表明，hACE2小鼠经鼻和胃内接种SARS-CoV-2后极易被感染，在肺Clara细胞和巨噬细胞中可见大量病毒复制。在老年hACE2小鼠中观察到的病理变化与COVID-19患者观察到的病理变化更相似。本文为研究SARS-CoV-2的传播和发病机制以及了解SARS-CoV-2在人类中的意外临床表现提供了一个hACE2小鼠动物模型。该模型对检测抗SARS-CoV-2的疫苗和治疗方法也有一定的价值。

原文出自：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1931312820303024