1.材料方法

(1)BALB/c小鼠感染设计、观察和采样检测方法：选择4～6周BALB/c小鼠，体重15～18g。每只动物经鼻腔滴入100TCID50病毒(50μl体积)。5只/笼，水料自取。每天观察动物的一般状况，包括眼、鼻、口、脸、耳、爪、四肢、肛门、尾、被毛、活动和精神状况。攻毒后每2d称重1次，从攻毒后第3，5，7，9，14天各处死3只动物取样，另留取10只小鼠观察其体重变化及死亡情况，直至感染后第14天。动物处死时取肺组织做RT- PCR检测和病毒分离，肺组织进行病理学检查。所有动物实验均在ABSL-3实验室内的隔离器中进行。

(2)病毒分离：尸检时取肺组织，研磨处理后，接种MDCK细胞，每天观察细胞病变，持续观察3d，用HA方法确认。

(3)H5N1病毒RNA的检测：H5N1病毒感染动物3d后处死，取肺组织放入1ml裂解液(Qiagen)中，用研磨器充分研磨，离心后取上清放入buffer RLT(已加入1％巯基乙醇)350μl，4℃ 13000 rpm离心3min，将上清转移至新1.5ml微量离心管中，提取样品病毒核酸。将RNA逆转成cDNA，通过荧光定量PCR仪直接测定病毒载量。提取病毒RNA操作步骤在ABSL-3实验室内完成。

(4)H5N1病毒抗体检测：动物在不同时间点处死采血分离血清，－80℃下保存备用。血清H5N1病毒特异性抗体检测参见雪貂HI检测。

(5)病理学研究：大体观察，处死动物后，详细观察肺、心、脾、肾、肝、脑、肠等组织的形态变化；病理切片制备，取处死动物的肺等组织，10％甲醛固定，石蜡包埋，常规病理组织切片处理后，HE方法染色后，镜检观察。

2.BALB/c小鼠感染H5N1模型指标和结果  攻毒组小鼠发病情况：BALB/c小鼠攻毒后第1天开始活动减少，拒食，竖毛等表现。3d开始死亡，攻毒后7d全部死亡。RT-PCR检测结果显示肺组织中存在大量H5N1病毒；病毒分离结果显示小鼠病毒在小鼠体内的复制高峰期是第2～6天。解剖可观察到小鼠肺实变，表面呈暗红色。病理学改变表现为局部支气管黏膜上皮坏死、脱落，黏膜炎细胞浸润明显，肺泡腔内有渗出，肺间隔内轻度增宽，为重度间质性肺炎(图8-4)。