全球新冠疫苗的研发，目前已经取得了很大进展，多种技术方式制备的疫苗已经进入临床II期。然而动物模型的相对短缺，很大程度影响了现阶段新冠疫苗的研发及临床试验的进程，我们需要更多地了解动物模型的选择、制备以及应用等多方面的信息，来完善疫苗或抗病毒药物的研发和生产步骤，为人类的生命安全和生存质量提供保障。 

SARS研究中的小鼠模型回顾

历史总是惊人的相似，从SARS到MERS，所用到的动物模型对我们现在选择新冠病毒动物模型都有着重要的借鉴意义。2016年美国国立卫生研究院传染病实验室Troy C Sutton和Kanta Subbarao教授发表综述性文章，详细论述了在研究冠状病毒的过程中动物模型的发展和应用。从小鼠模型来看，研究者用BALB/c近交系小鼠从鼻腔滴入SARS-CoV进行攻毒实验，但是结果发现，小鼠没有出现体重减轻、肺部病理等临床现象。用C57BL/6小鼠获得了相似的结果，仍然缺乏临床表型。在B6以及129SvEv背景条件下，缺乏NK细胞功能或者NK-T细胞的CD1-/-小鼠，和缺乏T和B淋巴细胞的RAG1-/-小鼠的病毒复制动力学相似，且均未出现临床疾病表型。B6背景的STAT1-/-小鼠在组织病理学检查中显示有自限性毛细支气管炎和片状间质性肺炎。但是，在129SvEv背景的STAT1-/-小鼠中，表现出进行性体重减轻和细支气管炎，并发展为间质性肺炎和纵隔炎。尽管小鼠显示出感染和肺部疾病的迹象，但近交系小鼠未能准确地再现在人类观察到的弥漫性肺泡损伤、水肿、肺细胞坏死和透明膜形成。 

为了模拟流行病学发现的高龄所导致的死亡率增加现象，研究者开发了SARS-CoV的老年小鼠模型。在此模型中，BALB/c和B6小鼠在肺中表现出高水平的病毒复制，并且这两种小鼠的体重均有减轻，成年BALB/c小鼠还表现出皮毛褶皱和脱水。所有试验观察到，老年小鼠模型对病毒的反应更接近人类所表现出的病毒感染表型，因此老年小鼠比年轻小鼠得到了更广泛的应用。 

图1. 转基因ACE2小鼠模型构建方案1

（参考文献：Paul B. McCray, Jr. et al. 2007） 

为建立SARS-CoV感染的致死小鼠模型，研究者们研发了表达人ACE2（hACE2）的转基因小鼠。通常，转基因小鼠的疾病严重程度与hACE2表达水平相关。在细胞角蛋白启动子控制下表达hACE2的转基因小鼠在肺、肝、结肠和肾脏中具有高水平的ACE2 mRNA。当这些小鼠接触到SARS-CoV，从气道上皮开始感染，逐渐扩散到大脑，到第7天时死亡率达到100％。 

图2. 转基因ACE2小鼠模型构建方案2

（参考文献：Chien-Te K. Tseng et al. 2007） 

另一种hACE2模型，是在巨细胞病毒IE增强子的鸡β-肌动蛋白启动子控制下表达hACE2，产生了具有不同水平的hACE2的转基因小鼠品系。用SARS-CoV感染hACE2高表达的小鼠产生了严重的肺部和脑部感染，死亡率为100％。这类小鼠表现出严重的间质性肺炎，伴有肺外器官损害，因此可以相对准确地模拟人类SARS-CoV感染的病理状态。

以上研究表明，在小鼠ACE2启动子的控制下表达hACE2，可导致hACE2的组织分布受到限制。受到SARS-CoV攻击的hACE2低表达的小鼠变得昏昏欲睡，但不会出现严重感染致死。研究还发现，在转基因小鼠的脑组织中观察到病毒载量或病毒抗原有所增加，并且由于病毒在脑中的广泛传播导致死亡率增加，而人类临床很少观察到中枢神经系统感染。因此，虽然转基因小鼠提供了SARS-CoV感染的致死模型，但没有小鼠模型能够全面精确地复制SARS-CoV感染患者被病毒感染的整个进程。 

在不断探索和验证SARS-CoV小鼠模型的过程中，我们发现基因编辑技术是小鼠模型发展的一个重要限制因素。随着CRISPR/Cas9的发现和普及，人源化小鼠模型应运而生。这种模型可以实现基因在特定时间和位点的插入及表达，更精准地模拟人类感染疾病的状态，更清晰地认识病毒与人类相互作用的方式和过程，这样我们就能够制备更合理的方案来应对各种并不友善的“天外来宾”。 

新冠病毒就是这样一个不速之客，它与SARS-CoV有着非常相似的地方，因此以上小鼠模型对于研究新冠病毒具有非常重要的借鉴意义。科研人员在这些研究的基础上运用新技术对模型进行更新和完善，构建了不同类型的新冠小鼠模型。那么，这些新冠小鼠模型是如何构建的呢？是否能准确全面地模拟人体感染病毒的过程呢？ 

多种新冠小鼠模型的比较分析

新冠小鼠模型研发的基础是基因编辑技术。所以我们需要进一步探讨，在目前基因编辑技术下所诞生的新冠小鼠模型是怎样制备的？它们的应用价值到底体现在哪里？ 

2020年6月5日，军事医学科学院北京微生物与流行病学研究所病原与生物安全国家重点实验室在《Cell Host & Microbe》发表了题为“A mouse model of SARS-CoV-2 infection and pathogenesis”的论文，该研究建立了一种新的hACE2转基因小鼠模型，通过新冠病毒攻毒实验，成功模拟了病毒在人体内的发病过程、病理特征和传播方式。 

图3. hACE2人源化小鼠的构建方案

（参考文献：Shi-Hui Sun et al. 2020） 

如上图所示，打靶策略是将hACE2完整的cDNA插入位于X染色体GRCm38.p6位点的mACE2基因第二个外显子处，这样就破坏并终止了mACE2的表达。将tdTomato基因插入带有内部核糖体进入位点（IRES）的hACE2下游，从而使hACE2和tdTomato共表达。添加了土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件（WPRE）和polyA序列，以增强mRNA的稳定性和翻译效率。该靶向策略允许hACE2的表达在mACE2启动子的调控下进行。将靶向构建体连同亚基因组RNA（sgRNA）和Cas9 mRNA一起注入C57BL/6小鼠的受精卵中。 

该小鼠模型采用CRISPR/Cas9敲入技术制备，将内源性小鼠ACE2（mACE2）替换为人类ACE2（hACE2），与野生型C57BL/6小鼠相比，年轻和年老的hACE2小鼠在鼻内感染后均在肺、气管和脑中维持高病毒载量。尽管未观察到死亡，但在新冠病毒感染的hACE2小鼠中发现了间质性肺炎和细胞因子升高。有趣的是，该研究还发现，新冠病毒在hACE2小鼠胃内接种也会引起感染并导致肺部病理改变，这为新冠病毒的感染和传播提供了一个新的思路。 

图4. C57BL/6和BALB/c制备ACE2的腺病毒转导新冠小鼠模型

（参考文献：Jing Sun et al. 2020） 

制备新冠小鼠模型除了转基因的方式之外，还有用腺病毒载体转导hACE2制备新冠模型小鼠的方法。2020年6月10日，广州呼吸疾病国家重点实验室赵金存教授团队联合多家单位共同发表了利用腺病毒载体制备的新冠小鼠模型，如图4所示，该研究通过复制缺陷型腺病毒（Ad5-hACE2）将外源hACE2通过鼻内转导的方式递送入C57BL/6和BALB/c两种品系及相应基因敲除的小鼠中，对小鼠进行攻毒实验，通过免疫印迹和流式细胞术检测hACE2的表达。 

研究观察到hACE2主要在肺泡上皮中表达，偶尔在气道上皮中有阳性细胞。感染新冠病毒的Ad5-hACE2转导的BALB/c小鼠以及C57BL/6在感染2天后开始出现皮毛起皱、驼背和呼吸困难等症状，类似于SARS-CoV感染BALB/c小鼠。两种小鼠品系的肺组织均显示出多种损伤，包括血管周围至间质性炎性细胞浸润、坏死细胞碎片和肺泡水肿。这些都表明，该方法制备的新冠小鼠模型对新冠病毒易感，能够有效评估疫苗和药物的疗效。 

图5. 利用AdV-hACE2转导的新冠小鼠模型制备中和抗体

（参考文献：Ahmed O. Hassan et al. 2020） 

华盛顿大学医学部研究团队用同样的方法，利用AdV-hACE2鼻内和静脉转导BALB/c小鼠制备新冠小鼠模型，结果表明，hACE2的腺病毒转导使SARS-CoV-2感染BALB/c小鼠，并且能产生高效中和抗体。 

赛业生物作为模式动物领域发展的领先者，在新冠疫情爆发初期，便组织研发团队全力开发新冠小鼠模型。我们利用自主研发的TurboKnockout技术和经过优化的CRISPR-Pro技术同步开展BALB/c、C57BL/6J、C57BL/6N三种背景品系的人源化小鼠制备，并综合考虑不同基因编辑方式的优缺点，设计了多种基因打靶方案，以满足不同研究目的和不同应用方向的需求。 

新冠疫情发生到现在已经有半年时间，而疫苗和抗病毒药物的研发逐渐明朗，虽然不能马上用于感染者进行预防和治疗，但抗疫取得了阶段性的胜利是有目共睹的。在这个过程中，小鼠成了人类抗疫路上的伟大助手，实现了它对人类的最大价值。人类共同命运，生物和谐生存，愿我们拥有一个更美好的地球家园。 

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参考文献：

1、Troy C Sutton and Kanta Subbarao. Development of Animal Models Against Emerging Coronaviruses: From SARS to MERS coronavirus. Virology. 2015

2、Paul B. McCray, Jr., Lecia Pewe, Christine Wohlford-Lenane et al. Lethal Infection of K18-hACE2 Mice Infected with Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus. Journal of virology. 2007

3、Tseng CT, Huang C, Newman P et al. Severe acute respiratory syndrome coronavirus infection of mice transgenic for the human Angiotensin-converting enzyme 2 virus receptor. Journal of virology. 2007

4、Chien-Te K. Tseng, Cheng Huang, Patrick Newman et al. Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Infection of Mice Transgenic for the Human Angiotensin-Converting Enzyme 2 Virus Receptor. Journal of virology. 2007

5、Shi-Hui Sun, Qi Chen, Hong-Jing Gu et al. A Mouse Model of SARS-CoV-2 Infection and Pathogenesis. Cell Host & Microbe. 2020

6、Jing Sun, Zhen Zhuang, Jian Zheng et al. Generation of a Broadly Useful Model for COVID-19 Pathogenesis Vaccination, and Treatment. Cell. 2020

7、Roberts, A., Deming, D., Paddock, C.D. et al. A mouse-adapted SARS-coronavirus causes disease and mortality in BALB/c mice. PLoS Pathog. 2007

8、Ahmed O. Hassan, James Brett Case, Emma S. Winkler et al. A SARS-CoV-2 infection model in mice demonstrates protection by neutralizing antibodies. Cell. 2020

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