摘要：斑马鱼是研究人类造血和血液恶性肿瘤的一种多功能、可靠的体内实验模型。作为脊椎动物，斑马鱼在解剖学和生物学上与人类有着显著的相似之处，包括造血系统。强大的基因组编辑和全基因组正向遗传筛选工具已经生成了可以重现人类恶性造血病变的斑马鱼模型，并揭示了与这些疾病有关的细胞机制。此外，在大规模化学筛选中使用斑马鱼模型可以帮助识别新的分子靶标并设计替代疗法。在这篇综述中，我们总结了血液学研究的最新成就，这些成就突出了斑马鱼模型对发现新的治疗分子的作用。 

关键词：斑马鱼 造血  白血病模型  异种移植  筛选

在过去的几年里，一些动物模型被用来研究血细胞形成的过程，即造血。事实上，不同的作者已经证明脊椎动物的整个造血过程在一定程度上是保守的，尽管存在一些差异。 斑马鱼与其他脊椎动物共享由相似的发育途径产生的所有主要血细胞类型。此外，在斑马鱼上发现了许多哺乳动物红细胞生成调控基因。在造血干细胞（HSC）的分化和成熟过程中，转录因子和主要信号通路也高度保守。值得注意的是，斑马鱼拥有形成血液的骨髓，脾脏和胸腺。在发育的后期，造血运动移至主动脉-性腺-中肾区域和胎儿肝脏，而在成人中，最终的造血发生在骨髓中，在那里产生了所有血细胞谱系。相比之下，斑马鱼的原始造血发生在中间细胞团（ICM）中，ICM是类似于哺乳动物卵黄囊血岛的区域。与哺乳动物一样，斑马鱼的血液发育涉及三个连续波：原始波，红系祖细胞（EPM衍生）波和在不同胚胎位置发生的确定波。原始波开始于受精后11小时，其特征是出现“原始”巨噬细胞和第一个循环红细胞。研究表明，髓系和红系祖细胞在解剖学上是分离的。

图1 a、 人类和斑马鱼的造血。 b、斑马鱼造血功能及其关键调控因子。斑马鱼造血示意图。原始波起源于两个部位，前外侧中胚层（ALM）（橙色）产生原始单核细胞，中间细胞团（ICM）（紫色）在24 hpf前主要产生原始红细胞。一个短暂的“中间”波出现在后血岛（PBI）中，红细胞和嗜异性细胞都在这里形成（灰色）。造血干细胞（HSCs）最初是由背主动脉腹壁的造血内皮细胞（blue）出芽形成的。HSC的一部分会迁移到尾部造血组织（CHT）（黄色），以产生几种细胞谱系，以及产生T淋巴细胞的胸腺（紫色）。最后，造血干细胞为发育中的肾脏（绿色）提供种子，肾脏是最终造血的场所，在那里红细胞、髓细胞和B淋巴细胞产生。用于调节此过程的谱系特异性转录因子呈红色。缩写：BP：B细胞祖细胞，CLP：普通淋巴祖细胞，CMP：普通髓系祖细胞，EP：红系祖细胞，Ery：红细胞，GMP：粒细胞-单核细胞祖细胞，Hemangio：成血管细胞，Hetero: 异嗜性细胞，HSC：造血干细胞，Mono：单核细胞，TP：T细胞子代。 

模拟人类恶性造血：肿瘤学研究的一个主要目标是确定哪些基因损伤会导致肿瘤，以及这些突变是如何在机制上激活白血病发生的。斑马鱼的造血功能与高等脊椎动物非常相似，许多与人类疾病基因同源序列的突变斑马鱼成功地复制了人类疾病的表型。血细胞的异常分化和不受控制的生长会导致血液疾病或肿瘤，根据与疾病有关的细胞类型对其进行分类。大多数造血系统恶性肿瘤是通过染色体易位和插入引起HSPCs癌基因异常激活而引起的。斑马鱼非常适合生成表达人类突变基因或携带与白血病发生有关的基因组改变的转基因系，而产生转基因动物的简便方法极大地促进了不同恶性造血模型的发展。每天可以对数百至数千个胚胎进行基因操作，以测试在人类白血病研究中发现的突变基因的功能。新技术工具的出现和斑马鱼生物学的易用性相结合，为在体内研究与白血病发生相关的人类基因提供了一个独特的机会。在过去的十年中，已经在斑马鱼中模拟了大量人类造血系统恶性肿瘤。通过建立稳定的转基因系或通过人类或斑马鱼与造血系统恶性肿瘤相关的癌基因的瞬时过表达来开发模型。此外，一些研究小组已经使用细胞类型特异性启动子来驱动人类癌基因和融合基因cDNAs在斑马鱼中的表达。恶性肿瘤的类型很多，但是在大多数情况下，可以根据进展速度进行分类。急性或慢性疾病以及转化的原始细胞类型：髓系或淋系。白血病有几种类型：急性髓性白血病（AML）、慢性疾病，如骨髓增生异常综合征（MDS）、骨髓增生性肿瘤（MPN）、慢性粒细胞白血病（CML）；急性淋巴细胞白血病（ALL）；慢性淋巴细胞白血病（CLL）。

T细胞急性淋巴细胞性白血病：

通过诱导小鼠c-Myc癌基因的表达，融合绿色荧光蛋白，并置于斑马鱼淋巴样组织特异性启动子重组激活基因2（rag2）的控制之下，建立了第一个斑马鱼血液系统恶性肿瘤模型。该模型重现了T细胞急性淋巴细胞性白血病（T-ALL），以淋巴小室增生和成纤维细胞（未成熟的T细胞）在不同器官和组织中浸润为特点。此外，斑马鱼Myc诱导的白血病以转录因子tal1 / scl和lmo2的双等位基因共表达为特征。不幸的是，Myc在rag-2启动子下的表达具有破坏性，大多数鱼类在性成熟前死亡，因此需要体外受精（IVF）来维持转基因系。为了避免早期致死，研究人员改用Cre-Lox条件系统和热休克启动子（hsp70）来暂时控制Cre的表达。这一改进的模型使研究人员能够探索从局部T淋巴细胞淋巴瘤（T-LBL）到弥散性T-ALL的分子事件。所有由Myc诱导的斑马鱼T-All模型均以T-LBL开始，伴有胸腺增生和局限性生长，然后发展为T-All并扩展到循环和其他组织中。三重转基因鱼（Myc：Cre：bcl2）通过抑制Myc诱导的细胞凋亡来加速T-LBL诱导。Myc诱导的T-ALL模型在了解肿瘤发生、白血病扩散和辐射敏感性的分子机制方面也有很大的贡献。

研究髓系恶性肿瘤：

通过与骨髓病相关的人类癌基因的瞬时过表达分析或通过生成稳定的转基因品系，在斑马鱼中模拟了骨髓增生性疾病。急性髓系白血病是成人最常见的急性白血病，其发病率随着年龄的增长而增加。急性髓系白血病是由于未分化的髓系前体细胞或原始细胞克隆性扩张，导致正常骨髓细胞置换和全血细胞减少。瞬时过表达分析是研究斑马鱼和其他动物模型中基因功能的最佳方法之一。通过这种方法，多种与造血系统恶性肿瘤相关的基因和融合癌基因在斑马鱼胚胎中得到表达。与髓系疾病相关的人类基因和融合癌基因通常具有胚胎致死性，需要组织特异性或诱导性启动子来驱动基因表达。

斑马鱼在药物发现中的应用：建立和研究斑马鱼白血病模型的最终目标是开发有效和毒性较小的治疗方法。由于斑马鱼在胚胎和幼体阶段体型较小，它是鉴定新的生物活性化合物和通过大规模化学筛选在体内测试化学物质的有力工具。斑马鱼允许使用96孔板进行高通量筛选（HTS），在一个实验中可以测试数千种化合物。由于光的透明性，可以分析活体个体内部器官的功能和形态变化。鉴于脊椎动物器官和组织在功能上的相似性，斑马鱼提供了独特的机会来鉴定与人类疾病或恶性肿瘤有关的分子和途径。

新治疗靶点的确定：最初，利用斑马鱼突变体设计化学筛选，目的是识别能够逆转疾病表型的途径和潜在疗法。也可以使用特定的荧光转基因品系对功能变化进行定量，完整的RNA原位杂交也可用于检测细胞分化标志物的表达。这是第一次“造血”筛选的情况，其中测试了3种不同数据库的2357种FDA批准化合物的文库，以鉴定调节斑马鱼胚胎中HSC形成的小分子。North等人 通过使用RNA原位杂交检查cmyb和runx1表达，发现35个能够增加AGM区HSC数量的分子。在这些物质中，有10种会影响前列腺素途径，而环氧合酶抑制剂会降低HSC数量。由于前列腺素E2（PGE2）是造血干细胞（HSC）生长的主要“促进剂”，作者用PGE2衍生物dmPGE2（16,16-二甲基-PGE2）处理斑马鱼胚胎，观察到AGM区runx1/cmyb阳性细胞的增加。他们还发现吲哚美辛抑制了90%胚胎中HSC基因的表达，这表明PGE2在AGM-HSCs的形成中起着特殊的作用。通过使用不同的斑马鱼报告基因和诱导系，Goessling等人研究结果表明PGE2在β-catenin降解水平上与wnt途径相互作用，以控制造HSC数量和活力。此外，对斑马鱼胚胎的研究发现cAMP/PKA途径是体内β-catenin蛋白稳定性的PGE2靶点。

如上所述，多项研究表明，斑马鱼白血病/ T-ALL模型在人类疾病方面具有高度转化性，因为它们在遗传，分子和细胞水平上与人类白血病极为相似。 Gutierrez 等人利用Tg（rag2:MYC-ER）斑马鱼系开发了一种基于荧光的筛选方法，以识别对MYC过度表达的白血病前胸腺细胞具有选择性活性的小分子。羟哌氯丙嗪（PPZ）是一种FDA批准的吩噻嗪类抗精神病药物，通过人T-ALL细胞系的辅助筛选，证实了其对MYC过度表达胸腺细胞的选择性毒性。

图2、使用斑马鱼开发患者特异性治疗的不同策略。从病人体内分离出白血病血细胞，直接注入2dpf幼虫卵黄囊（体内异种移植）。另一方面，导致造血系统恶性肿瘤的异常基因（红点）可以被识别，并将其用于开发斑马鱼转基因人类疾病模型（转基因方法）。考虑到尺寸和操作的简单性，这两种策略都非常适合于大规模的活体实验。异种移植和转基因幼虫都可以用来测试数千种不同的化学分子，以期识别新的治疗化合物。

结论：斑马鱼的研究为理解发育和病理造血的细胞机制提供了巨大的贡献。诸如造血内皮细胞产生的HSCs、PGE2的促进特性以及血管周围生态位中的细胞相互作用等发现，强调了该模型在阐明造血发育所需复杂过程中的重要性。此外，从斑马鱼模型中获得的人类血液疾病的见解允许识别新的参与造血细胞恶性转化的分子途径。斑马鱼对造血的研究证明了该模型在研究多种造血表型方面的能力，并为个性化治疗提供了新的工具。

原文出自：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925443918305015