重组SARS-CoV-2棘突 S1-Fc融合蛋白在非人类灵长类动物中诱导高水平的中和反应

摘要：在这项研究中，我们检测了CHO表达的重组SARS-CoV-2 s1-Fc融合蛋白作为COVID-19疫苗的潜在候选物在小鼠、兔和猴中的免疫原性。我们证明S1-Fc融合蛋白具有极强的免疫原性，如第7天观察到的强抗体滴度所证明。通过假病毒中和试验，用S1-Fc融合蛋白免疫家兔，第14天观察到较强的病毒中和活性。最重要的是，在少于20天的时间内和三次注射S1-Fc融合蛋白后，在一次SARS-CoV-2感染检测中，两只猴比一名恢复的COVID-19患者产生了更高的病毒中和效价。我们的数据表明，CHO表达的SARS-CoV-2 S1-Fc重组蛋白可能是针对COVID-19的疫苗开发的有力候选者。

关键词：COVID-19  SARS-COV-2 棘突蛋白 疫苗

简介：作为目前没有有效治疗或药物的新型冠状病毒，迫切需要开发疫苗。 已经出现了几种开发COVID-19疫苗的方法，包括DNA疫苗，RNA疫苗，病毒载体疫苗，重组亚单位疫苗和死病毒制剂。其中，来自Moderna的RNA疫苗最早于3月初在美国进入人体试验，随后Cansino的腺病毒载体疫苗也于同月晚些时候在中国开始人体试验。鉴于棘突蛋白是在最初的感染中是介导病毒细胞融合的受体结合蛋白，它已被确定为疫苗设计的主要靶点。棘突蛋白共有1273个氨基酸，根据其结构和功能可分为两个主要结构域。前一半是S1蛋白，它包含受体结合结构域（RBD）序列，位于刺突蛋白的N末端。后半部分是S2，它是三聚体结构，支持S1的RBD，并具有融合束，当S1与ACE 2接触后，融合束突出到宿主细胞的膜中。由于大多数中和表位位于S1区域内，因此包含RBD，S1全长，S全长（S1 + S2）甚至是三聚S途径的蛋白质被认为是疫苗开发的候选者。在这项研究中，我们将全长SARS-CoV-2 S1蛋白（GenBank：QIC53204.1，Gln14-Arg685）与人IgG1的Fc区（GenBank：CAR58103.1，Glu98-Lys329）融合在一起，作为候选疫苗， 使用稳定的CHO-K1细胞系表达了重组蛋白。纯化的S1-Fc蛋白用不同的佐剂配制，用于免疫不同种类的动物，如小鼠、兔和猕猴。除了在所有测试的动物中引发高水平的抗S1抗体外，在猕猴的抗血清中也发现了针对SARS-CoV-2的高中和活性。这些结果表明，S1-Fc融合蛋白可以在各种动物中有效诱导体液免疫反应，并且可以在猕猴中引起高水平的中和抗体。

材料和方法：AD11.10和AD20Gold +（含合成MPL的纳米乳液）佐剂来自中国Advaccine。弗氏完全佐剂（CFA）购自美国SIGMA。雌性BALB / c小鼠购自中国维通利华。将小鼠分组饲养，而将兔和猕猴分别笼具中饲养。对所有动物的饮用水进行纯化和高压灭菌。

免疫接种： 按照制造商的说明，用CHO表达的SARS-CoV-2 S1-Fc融合蛋白联合佐剂免疫4周龄雌性BALB / c小鼠，12-15周龄雌性NZW兔和3至4岁的猕猴。佐剂AD20Gold 联合S1-Fc融合蛋白免疫4周龄雌性BALB / c小鼠（第0、3、7天肌注9.2μg，第9天和第11天肌注减至0.575μg）。佐剂AD20Gold 联合S1-Fc融合蛋白免疫新西兰兔（第0、4、7天肌注100μg，第11、14和第18天肌注减至50μg）。佐剂CFA联合S1-Fc融合蛋白用于首次免疫猕猴，后有佐剂AD11.10联合S1-Fc融合蛋白加强免疫（首次皮下注射为250μg，第4、9、22和26天加强为250μg）。免疫过程示于表S1中。 在不同时间点采集血样以测量抗体水平和中和效价。

酶联免疫分析：96孔板上涂有1.5μg/mL的SARS-CoV-2s1-6×His蛋白，，用3%BSA-PBS封闭。血清的系列稀释首先用相同物种的正常血清稀释，再用样品稀释缓冲液（20％小牛血清-PBS，20％CS-PBS）稀释。将100μL的稀释样品加入到平板的每个孔中。捕获的抗体用辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗进行检测。最终洗涤后，加入HRP底物TMB溶液，并使用酶标仪在450 nm处测量吸光度。

假病毒中和试验：在37°C和5％CO2的条件下，将HEK 293 T细胞和ACE2过表达的HEK 293 T细胞（ACE2-293 T）在添加10％热灭活胎牛血清（FBS，Gibco），50 U / ml青霉素（Gibco）和50μg/ ml链霉素（Gibco）的DMEM培养基中培养 。使用Lipofectamine 2000试剂，将HEK 293 T细胞同10μg编码SARS-CoV-2s蛋白的质粒和10μg 表达荧光素酶的缺乏env的HIV载体共转染。48小时后，收集含假病毒的培养物上清液，过滤（0.45μm），并在-80°C下以1 ml等分试样保存。在ACE2-293 T细胞中确定单次解冻的伪病毒等分试样的50％组织培养物感染剂量（TCID50）。对于TCID50测量，将假病毒的系列稀释液添加到预先接种在96孔板中的ACE2-293 T细胞中。孵育12小时后，将培养基换成含10％FBS的DMEM，并将细胞再培养48小时。用裂解缓冲液裂解细胞，然后加入萤光素酶底物。使用GloMax 96微孔板发光计测量荧光素酶活性，将产生相对平均背景值三倍以上的相对发光单位（RLU）的孔定义为阳性。感染前一天将ACE2-293 T细胞接种到96孔板中。 将血清样品在56°C灭活0.5 h，然后连续稀释3倍，并与200 TCID50的假病毒在37°C孵育1 h。然后用这些混合物感染ACE2-293t细胞，平行样3个。感染12小时后，向孔补充新鲜培养基，并在48小时后确定细胞的萤光素酶活性。用裂解缓冲液裂解细胞，然后加入萤光素酶底物。使用GloMax 96微孔板发光计（Promega）测量萤光素酶活性，并将产生相对平均背景值三倍以上的相对发光单位（RLU）的孔定义为阳性。使用SPSS软件通过概率分析计算50％中和效价。

SARS-CoV-2中和试验：选择CN1菌株进行中和试验。使用微量细胞病变效率（CPE）法测定SARS-CoV-2病毒滴度。将10倍稀释的病毒样品与1–2×104 Vero细胞混合，然后在96孔培养板上进行培养。在36.5°C的5％CO2培养箱中培养3-7天后，在显微镜下检查细胞是否存在细胞病变作用（CPE）。 病毒滴度通过Karber方法计算。血清标本在56℃灭活0.5h，用细胞培养基分两步连续稀释。稀释后的血清与100 TCID50的SARS-CoV-2混悬液按1:1的比例混合在96孔板中，然后在36.5℃的5%CO2培养箱中孵育2h。然后将1-2×104 Vero细胞添加到血清-病毒混合物中，，并在36.5℃下在5%二氧化碳培养箱中培养5天。在显微镜下记录每孔的CPE，并通过50％保护作用的稀释数计算中和效价。

结果：SARS-CoV-2 S1-Fc融合蛋白的制备：为了便于纯化，S1亚单位（14Q-685R）与人IgG1的Fc片段进行了基因融合，构建在pEE12.4中，并在稳定的CHO细胞系中表达。使用Protein-A柱从培养上清液中纯化S1-Fc融合蛋白，在还原和非还原条件下，用SDS-PAGE凝胶对S1-Fc蛋白的纯度进行了评价。检测到130-180 kD之间的条带是S1-Fc的单体，而远高于180 kD分子量标记的单条带为二聚体。

SARS-CoV-2 S1-Fc融合蛋白免疫动物的实验研究：用含CFA和AD11.10的S1-Fc蛋白免疫1只雌性和1只雄性猕猴。分别于第一次免疫后第5、8、15、22、32天采集血清，用ELISA法检测SARS-CoV-2 S1-6×His蛋白。首次用与IgM、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4反应的HRP偶联山羊抗人IgG（H+L）二抗检测SARS-CoV-2s1蛋白总抗体效价。第8天，仅在雌性猕猴体内检测到抗S1总抗体。在第15天，两只猕猴的抗S1总抗体滴度都很好。在第22天，雌性猕猴的总抗SARS-CoV-2 S1抗体滴度下降了30％。在第22天再一次加强免疫，在第32天，两只猕猴的总抗体滴度均大大提高。

图1. S1-Fc免疫猕猴中的抗SARS-CoV-2 S1抗体水平。

此外，我们使用HRP标记的抗人IgG-Fc和HRP偶联的小鼠抗人μ链同型特异性次级抗体来重新检测血清中IgG和IgM的水平。第8天仅在雌性猕猴中观察到抗S1 IgG抗体。在第15天，两种猕猴体内都检测到了很强的抗S1-IgG滴度，同时也检测到了IgM水平。有趣的是，在第22天再次S1-Fc增强免疫后，第32天仅抗S1-IgG滴度大幅增加，同时未观察到明显的抗S1-IgM滴度。使用相同的ELISA分析，我们检查了从COVID-19患者不同天采集的血浆样品中抗S1 IgG和IgM抗体的水平。在疾病发作后4天可以检测到IgG抗体，并且在第12天滴度增加，但在第20天滴度显著降低。

图2. COVID-19恢复期患者血清中的IgG和IgM水平。

本研究的初衷是制备阳性对照的SARS-CoV-2s1抗体，用于SARS-CoV-2疫苗的研制和血清学检测。一些免疫接种是在弗氏完全佐剂（CFA）的帮助下完成的，它不适合人类接种疫苗。然而，在第0天和第10天两次肌肉注射后，在用0.5 ml AD10.11佐剂联合50μg S1-Fc免疫蛋白的一只雌性猕猴中也观察到了高抗S1抗体滴度。为了证实这一观察结果，随后，我们将佐剂从苛刻的CFA改为了AD20Gold +（含合成MPL的纳米乳液），该佐剂旨在供人类使用，以研究S1-Fc作为人COVID-19疫苗候选物的潜力。

如先前所述，用S1-Fc蛋白免疫五只4周龄的雌性BALB / c小鼠。于第38天采集血清，用HRP偶联的山羊抗鼠IgG-Fc特异性二抗对SARS-CoV-2  S1-6×His蛋白进行ELISA检测。所有五只小鼠均产生强抗S1 IgG抗体效价。

图3. S1-Fc免疫的小鼠和兔中抗SARS-CoV-2 S1的抗体水平

用佐剂AD20Gold+联合S1-Fc蛋白免疫新西兰兔。在第27天采血进行抗S1抗体效价检测。与在小鼠中观察到的相似，S1-Fc免疫兔也产生了非常高的针对S1蛋白的滴度。

SARS-CoV-2 S1-Fc融合蛋白抗血清的中和活性：用假病毒或SARS-CoV-2活病毒检测S1-Fc免疫血清的病毒中和活性。我们比较了S1-Fc免疫猕猴血清和SARS-CoV-2患者血浆样品的中和效价。将热灭活的血清样品与100 TCID50的活SARS-CoV-2悬浮液在36.5°C下预孵育2 h，然后与1-2×104 Vero细胞混合，并在36.5°C下共培养5天 。在显微镜下记录每个孔的细胞病变效应（CPE）。COVID-19患者血清的病毒中和滴度在第4天和第12天为512，但在发病后第28天降至384，与上述第20天和第28天血浆样本中抗体水平的下降相匹配。佐剂CFA +AD11.10联合SARS-CoV-2 S1-Fc融合蛋白免疫，在第15天的两只猕猴中都诱导了很高的中和活性，效价均大于1024。

图4、S1-Fc免疫猕猴和COVID-19恢复期患者血清的中和效价。

还使用SARS-CoV-2假病毒检查了经S1-Fc免疫的兔或猕猴的血清的中和活性。简而言之，将热灭活的血清样品与200 TCID50假病毒在37°C下预孵育1 h。 然后将混合物用于感染ACE2-293 T细胞。三天后，测量感染细胞的荧光素酶活性。免疫后第27天，用AD20Gold +作为佐剂免疫SARS-CoV-2 S1-Fc融合蛋白也诱导了很高的中和活性，IC50效价> 3000，IC90效价在440-501左右。用佐剂AD20Gold+联合SARS-CoV-2s1-Fc融合蛋白免疫，在免疫后27天，两只兔的IC50滴度>3000，IC90滴度在440-501左右。在第32天，两只S1-Fc免疫猕猴的血清中也观察到了极好的中和效价。虽然雄性猕猴比雌性猕猴产生的抗SARS-CoV-2s1蛋白抗体速度慢，但令人惊讶的是，它的中和效价（3741）比雌性猕猴（1798）高得多。

图5、S1-Fc免疫兔和猴抗血清的假病毒中和活性。

数据清楚地表明，CHO表达的全长SARS-CoV-2s1-Fc融合蛋白可以在很短的时间内获取针对SARS-CoV-2的非常强的中和活性，是研制COVID-19疫苗的一个很好的候选物。

结论：我们建立了一个稳定表达SARS-CoV-2s1蛋白的CHO-K1细胞系，蛋白C端融合人IgG-Fc。CFA和AD11.10或AD20Gold +联合纯化的重组S1-Fc融合蛋白可用于免疫小鼠，兔和猕猴。结果表明，S1-Fc融合蛋白可以有效地诱导各种动物的体液免疫反应，最重要的是，它能在非人灵长类动物中诱导高水平的中和抗体。

原文出自：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X20308525