信达、罗氏、默沙东、Tesaro(GSK)的抗肿瘤药物选择了何种临床前动物模型？

本文将通过10个来自药企/CRO/科研院所的肿瘤免疫治疗的实际研发案例，探讨关于构建临床前人源化模型的4个关键因素（宿主小鼠、移植细胞类型、研究窗口期、肿瘤微环境）。

传统的抗肿瘤药物（如化疗药、小分子抗肿瘤药物、肿瘤抗体靶向药等）治疗靶点在于肿瘤细胞，但由于对正常组织细胞的杀伤以及靶向药物的易耐药特性，治疗效果差强人意。而目前肿瘤研发工作的重点已经转向了更复杂和更具特异性的肿瘤免疫疗法。

肿瘤免疫疗法，旨在让研究者通过激活或者增强人类的免疫系统来对抗自身的癌症。目前研究火热的CAR-T细胞治疗、单克隆抗体类免疫检查点抑制（PD-1/CTLA4）、双特异性抗体、ADCC、肿瘤疫苗等都属于肿瘤免疫疗法的范畴。显而易见，传统的抗肿瘤药物研究，只需要肿瘤异种移植模型即可开展相应的研究，而肿瘤免疫疗法的研究，需要免疫系统的参与，动物模型需要同时具备人免疫系统和人肿瘤组织。

作为能够在动物体内模拟人类免疫系统和癌症之间相互作用的工具，人源化小鼠成为了肿瘤免疫疗法的重要动物模型。虽然尚且无法实现完整和完全功能的人体免疫重现，但是已经建立了多种人体免疫细胞组成的有效模型。最常见的两个人类免疫系统重建的方案是移植人外周血单核细胞 ( huPBMC ) 和人造血干细胞 ( huHSC- CD34+ ) 。

这些模型在宿主小鼠的选择、移植的细胞类型、研究窗口期、重建后的人体免疫细胞种类及发育等方面有所不同，因此必须根据研究课题谨慎选择适当的模型。

肿瘤免疫疗法中构建临床前人源化研究模型需要考量哪些关键因素？

研究者确定所研药物的靶点在某种特定免疫细胞后，如何选择并建立理想的免疫系统重建模型呢？一旦客户提出这方面的想法，我们会与客户一起仔细探索以下4个问题。

01选择何种宿主小鼠？

应该选择何种宿主小鼠进行免疫系统重建呢？早期研究者曾尝试使用CB-17 SCID（T、B细胞缺失）、NOD SCID（T、B缺失，NK细胞和巨噬细胞缺陷）进行人源化重建，虽然实现了一定比例的重建，但重建比例非常低，无法满足研究者的研究需求，且这些模型仍存在一定的局限性，如外周淋巴器官中人类细胞水平非常低，无法进行功能性免疫应答、易发生的免疫渗漏现象、胸腺淋巴瘤发生率高等，限制了肿瘤免疫疗法的进展。直到2002年，日本CIEA开发的NOG小鼠实现了根本性的突破，在NOD-SCID小鼠的IL-2受体γ（IL2rγ）链上添加靶向突变，NK细胞缺失，不仅大幅度提升了人免疫系统的重建水平，也使得多种CDX/PDX异种移植模型的成功率大大增加。这种“肿瘤-免疫系统”双人源化成功，为肿瘤免疫临床前体内研究提供了理想模型。

02 选择何种细胞类型进行移植？

何时选择huHSC？

若药物研发需要人源T细胞参与和较长的研究周期，研究者往往倾向于选择huHSC-NOG人源化小鼠，因其研究周期（窗口期）长达1年，且可以稳定重建出功能完善的人源T细胞。多种肿瘤免疫疗法，比如PD-1抑制剂的研发，还有目前更有前景的组合疗法（双特异性抗体+免疫检查点抑制剂、溶瘤病毒+免疫检查点抑制剂、偶联抗体-免疫检查点抑制剂等）都在huHSC-NOG的肿瘤异种移植模型中进行了评估。

2017年AACR会议，罗氏（Roche）公司公布了CEA-TCB（CD3-CEA双特异性抗体）化合物用于治疗表达CEA（癌胚抗原，carcinoembryonic antigen）的实体瘤研究结果，研究中使用huHSC-NOG小鼠用于体内评估实验，表明CEA-TCB作为单一疗法具备抗肿瘤活性，并且与Tecentriq（atezolizumab，anti-PD-L1）联合使用时进一步获得增强[1]。

CEA-TCB（RO6958688; RG7802）是罗氏（Roche）公司开发的一种新型T细胞双特异性抗体，可同时结合T细胞和肿瘤细胞，是实体瘤（结直肠癌）治疗领域的重大突破。目前CEA-TCB已于2019年9月完成一期临床。

Tecentriq（atezolizumab，阿替利珠单抗）是罗氏公司开发的一款PD-L1药物，自2016年获得FDA批准后，几年内其获批的适应症涵盖多个癌症种类，包括：尿路上皮癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、三阴乳腺癌等。Tecentriq也是中国获批的第二个PD-L1药物。罗氏为Tecentriq制定了广泛的开发计划，包括Tecentriq单独用药或与其他药物联合治疗的研究。

Lukasz Kuryk et al.在溶瘤腺病毒ONCOS-102与pembrolizumab（Keytruda®）联合疗法治疗黑色素瘤的临床前研究中使用 huHSC-NOG小鼠进行临床前评估，植入A2058黑色素瘤细胞的人源化小鼠在ONCOS-102治疗后显示出明显的肿瘤缩小，与pembrolizumab联用可更大程度地减少肿瘤体积[2]。

再如默沙东（美国默克公司，Merck & Co., Inc.）2017年在AACR年会公布的研究中使用人源化小鼠模型huHSC-NOG评估PD-1单抗pembrolizumab（帕博利珠单抗，Keytruda®）的抗肿瘤活性[3]。

将huHSC-CD34+ 移植到NOG小鼠12-16周后，可在动物的外周血、骨髓、胸腺和脾脏中检测到多种免疫细胞，主要是T/B 细胞。将huHSC-CD34+ 移植到幼体和成年动物中最常见的是通过尾静脉注射。用于移植的造血干细胞可以从多种来源获得，最常用的是脐带血。

huHSC-NOG模型和huHSC-NOG-EXL模型（下文将介绍），在越来越多的抗肿瘤组合疗法中受到研究者的青睐，但造模周期长（造血干细胞在小鼠体内需要12-14周的分化过程），且造模前需对动物进行辐照（辐照仪器受限，辐照剂量不好控制），使得研究者们对这个模型爱恨交织。为了方便研究者的时间安排，维通利华维持了一定数量的huHSC-NOG小鼠和huHSC-NOG-EXL小鼠库存（hCD45≧25%），免去研究者3-4个月的研究等待期。

何时选择huPBMC？

既然huHSC-NOG小鼠模型可以实现多种免疫细胞重建，为何还需要开发PBMC人源化模型呢？

PBMC人源化模型的构建过程快且成本低，可以快速重建人T细胞，适用于短期研究。超重度免疫缺陷鼠（如NOG）移植PBMC后可以实现T细胞的快速扩增并迅速投入使用，这种方法建立的模型无需辐照，操作简单且成本低。研究者通过合理设计实验，根据肿瘤的生长快慢，提前接种肿瘤，或者将PBMC移植与肿瘤同时接种，尽可能获得更多的实验窗口期，此模型已在PD-1免疫检查点抑制剂及双特异性抗体药物研发中获得大量应用。

2019年8月信达生物在抗体领域权威杂志mAbs发表的文章中评估了Sintilimab（信迪利单抗）在人源化huPBMC-NOG小鼠中的PD-1受体占用率和抗肿瘤功效。在人源化NOG小鼠模型中，Sintilimab在循环T细胞上显示出优异的PD-1占用和对NCI-H292肿瘤的抗肿瘤作用[4]。

信迪利单抗是信达生物制药(苏州)有限公司自主研发的创新生物药，为全人源化的IgG4单克隆抗体，能特异性结合T细胞表面的PD-1分子，阻断这条免疫逃逸通路，重新激活T细胞，释放细胞因子杀伤肿瘤细胞。

2018年12月27日sintilimab获NMPA批准，成为国内第二个获批上市的国产PD-1抗体。

在2018年AACR年会，CIEA公布的评估2种免疫检查点抑制剂Keytruda®（帕博利珠单抗）和Opdivo®（纳武单抗）的研究中，使用huPBMC-NOG作为免疫检查点抑制剂激活人类T细胞的体内评估模型[5]。

2017 Anja Seckinger et al.在《Cancer Cell》发表的用于多发性骨髓瘤治疗的BCMA-T细胞双特异性抗体EM801的研究中，使用huPBMC-NOG小鼠模型评估药物在体内的抗肿瘤活性[6]。

上文曾提到罗氏公司开发的双特异性抗体CEA-TCB用于治疗表达CEA的实体瘤，除了使用huHSC-NOG小鼠，还曾在2016年发表的文章中提到使用huPBMC-NOG模型评估CEA-TCB（CD3-CEA双特异性抗体）的抗肿瘤活性。实验中将肿瘤细胞/ PBMC混合物皮下移植（注射）到NOG小鼠体内构建临床前动物模型，选用了110中细胞系进行体内和体外实验，结果表明药物可以增加肿瘤中T细胞浸润的能力，并将PD-L1“冷肿瘤”转化为PD-L1“热肿瘤”[7]。

构建huPBMC-NOG模型无需进行辐照预处理，只需将少量huPBMC通过简单的尾静脉注射即可。huPBMC-NOG小鼠在移植后2-4周，T细胞重建稳定，但B细胞重建情况较差。huPBMC-NOG模型重建了人源成熟的T细胞，由于人源活性T细胞，与鼠源MHC不一致，移植后会对小鼠进行攻击， 移植后4-6周会出现GvHD（移植物抗宿主病），这意味着可能只有4-6周的实验窗口期，所以研究者需要清晰地了解肿瘤的生长时间，合理设计huPBMC与肿瘤细胞的移植时间。

下图是AACR用huPBMC-NOG小鼠的设计方案，可供研究者参考。总的来说，PBMC人源化模型可以满足以研究T细胞功能 (如双特异性抗体、免疫检查点抑制剂/激动剂) 为目标的短期研究。

03 如何延长移植huPBMC后实验“窗口期”？

移植huPBMC构建人源化模型是简单且有效的，但是研究周期短限制了其更广范围的应用。怎样才能“扬长避短”，保持其优势，改善移植后的GvHD反应呢？NOG-dKO（NOG-MHC I/II -2 KO）小鼠应运而生。在NOG小鼠上敲除MHC I类和MHC II类亚型的轻链基因，使得huPBMC移植后，无法识别小鼠细胞表面的MHC分子，不能进行免疫攻击。将huPBMC移植到NOG-dKO小鼠重建的免疫系统人源化模型，GvHD大幅减轻，窗口期可延长至12周。

日本静冈癌症中心2019年发表的文章中使用人淋巴瘤细胞SCC-3或胶质母细胞瘤细胞U87的人源化NOG-dKO小鼠用作免疫治疗模型，评估PD-1抗体的抗肿瘤作用。移植后4周内，经抗体处理的小鼠中，脾脏内人CD45 +细胞约占70％，抑制了肿瘤的生长：肿瘤的体积缩小50％以上[8]。NOG衍生品系NOG-dKO小鼠的更多详细内容我们将在后续文章中与您分享。

04 如何重建髓系细胞，更好地模拟肿瘤微环境？

NOG小鼠虽然在移植huHSC后可分化出免疫细胞，但主要是T/B细胞，而NK细胞和髓系细胞(如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞)含量较低，无法满足药物靶点在髓系细胞或者NK细胞的研发需求，此时则需要另一个NOG衍生品系NOG-EXL小鼠模型。NOG-EXL小鼠是在超重度免疫缺陷小鼠NOG转入编码人GM-CSF和IL-3基因。huHSC移植后，hGM-CSF和hIL-3的表达利于髓系细胞的分化，移植后16周，NOG-EXL小鼠中人源髓系细胞、单核细胞、粒细胞、T细胞重建水平均有所升高，更好的模拟人类复杂的肿瘤异质性及肿瘤微环境，可用于研究更多免疫细胞及分子参与的肿瘤免疫疗法。

来自Tesaro公司（专注肿瘤治疗的创新生物制药公司，2018年被GSK收购）的研究者们2019年发表的文章中使用huHSC-NOG-EXL作为临床前肿瘤模型，观察了使用其研发药物PARP抑制剂Niraparib（尼拉帕利）治疗对肿瘤微环境的影响，并评估了使用Niraparib和抗PD-1免疫检查点抑制剂联合疗法的治疗潜力[9]。

Niraparib：一种口服的强效聚合酶抑制剂，用以治疗卵巢癌或乳腺癌，2017年3月27日，FDA批准Niraparib (ZEJULA)用于对复发性卵巢上皮癌、输卵管癌或原发性腹膜癌的成年患者进行维持治疗，这是第三个上市的PARP抑制剂。2019年在中国大陆获批上市。

2018年，GSK（葛兰素史克）以51亿美元收购TESARO。2019年，美国FDA批准GSK尼拉帕利（Niraparib）用于治疗晚期卵巢癌患者。

Tesaro公司2019年还发表了使用huHSC-NOG-EXL为肿瘤模型评估LAG-3+PD-1 blockade联合疗法研究结果，抗LAG-3增强了PD-1单一疗法的抗肿瘤功效，与单一疗法相比，治疗结果明显改善，特别是对卵巢癌，黑色素瘤，肉瘤和结肠癌等适应症[10]。

昭衍新药曾有研究结果表明huHSC-NOG-EXL可在临床前研究中用于预测评估CAR-T细胞治疗产品的细胞因子释放强度，此研究成果我们将在后续介绍NOG-EXL文章中与您分享。

此外，huHSC-NOG及huHSC-NOG-EXL模型中NK细胞均含量极低，且功能受损，如需研究基于NK细胞的肿瘤免疫疗法则需要另一种NOG衍生品系——hIL-15 NOG（该模型将于2021年初在国内上市销售）。

小结

与huPBMC-NOG相比，huHSC-NOG人源化模型的两个关键优点  1. 无GvHD反应，能够进行长期研究  2.多种免疫细胞重建，主要是T/B细胞。基于以上两个优点，huHSC-NOG模型适用于多种肿瘤免疫疗法评估，尤其是研究周期较长的组合疗法。

huPBMC-NOG模型可用于以T细胞为靶向的短期药物研究(如双特异性抗体、免疫检查点抑制剂/激动剂)，且周期短，成本低。

huPBMC-NOG-dKO模型窗口期可达12周，制备周期短，成本低，适用于使用huPBMC-NOG不能满足研究窗口期的肿瘤研究（尤其是成瘤慢的肿瘤类型）。

huHSC-NOG-EXL模型可重建髓系细胞，更好的模拟人类复杂的肿瘤异质性及肿瘤微环境，适用于需要髓系细胞参与的肿瘤免疫研究。

模型详解

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人源化动物模型详解

参考文献

[1] Marina Bacac, Sara Colombetti, Linda Fahrni,et al. Abstract 1594: Enhancement of the anti-tumor activity of CEA TCB via combination with checkpoint blockade by PD-L1 and interleukin-2 variant immunocytokine[J]. Cancer Research, 2017, 77(13 Supplement):1594-1594.

[2] Kuryk L , Anne-Sophie W. Møller, Jaderberg M . Combination of immunogenic oncolytic adenovirus ONCOS-102 with anti-PD-1 pembrolizumab exhibits synergistic antitumor effect in humanized A2058 melanoma huNOG mouse model[J]. OncoImmunology, 2019, 8(2):-.

[3] Linn D, Cristescu F, Ray K, et al. Evaluating anti-tumor activity of the human anti-PD-1 antibody pembrolizumab using humanized mouse models. Proceedings: AACR Annual Meeting 2017; April 1-5, 2017; Washington, DC.

[4] Wang J , Fei K , Jing H , et al. Durable blockade of PD-1 signaling links preclinical efficacy of sintilimab to its clinical benefit[J]. mAbs, 2019, 11(8).

[5] Nishime C, Katano I, Nishinaka E, et al. In vivo evaluation model of human T cell activation by immune checkpoint inhibitors using human PBMC-transferred NOG mouse.Proceedings: AACR Annual Meeting 2018; April 14-18, 2018; Chicago, IL.

[6] Seckinger A, Delgado JA, Moser S, et al. Target Expression, Generation, Preclinical Activity, and Pharmacokinetics of the BCMA-T Cell Bispecific Antibody EM801 for MultipleMyeloma Treatment. Cancer Cell. 2017;31(3):396-410

[7] Bacac M, Fauti T, Sam J, et al. A Novel Carcinoembryonic Antigen T-Cell Bispecific Antibody (CEA TCB) for the Treatment of Solid Tumors. Clin Cancer Res. 2016;22(13):3286-97.

[8] Ashizawa T , Iizuka A , Nonomura C , et al. Antitumor effect of programmed death-1 (PD-1) blockade in humanized the NOG-major histocompatibility complex (MHC) double knockout mouse[J]. Clinical Cancer Research An Official Journal of the American Association for Cancer Research, 2017, 23(1):149.

[9] Wang Z, Sun K, Xiao Y, et al. Niraparib activates interferon signaling and potentiates anti-PD-1 antibody efficacy in tumor models. Sci Rep. 2019;9(1):1853.

[10]  Ghosh S , Sharma G , Travers J , et al. TSR-033, a Novel Therapeutic Antibody Targeting LAG-3, Enhances T-Cell Function and the Activity of PD-1 Blockade In Vitro and In Vivo[J]. Molecular Cancer Therapeutics, 2018.