2000年发现的新一代声学造影剂，可经静脉注射并通过肺循环使左心室心肌显影，即为心肌声学造影(myocardial contrast echocardiography, MCE)。该方法为无创性评价冠脉微循环灌注及心肌存活性开辟了崭新途径。本节介绍犬冠状动脉再灌注/无(缓)复流模型的制作及其心脏超声(cardiac ultrasonography)、心肌声学造影评价方法。

(一)实验动物  健康杂种犬，雌雄不限，体重12～25(19.57±2.93)kg，实验前预先进行适应性饲养7～10天。

(二)仪器与设备  心电图仪，除颤器，心电和有创压力监测系统，X线血管造影机，电脑彩色超声系统，2.5～4.0MHz 3V2超声探头及MO磁光盘、超声数据处理工作站。5F动脉穿刺鞘、1.33mm(4F)冠脉造影导管及左心室造影导管，导引导管和0.036英寸超滑造影导丝，0.014英寸导引导丝和PTCA球囊，超声细胞震荡仪，光学显微镜，红细胞计数板。

(三)试剂  碘普罗胺370血管造影剂、全氟丙烷气体(perfluoropropane gas, C3F8, 纯度99.0％，碳水化合物总量<10ppm，分子量184g/mole)、20％人体白蛋白。

(四)MCE造影剂(MCE imaging agent, MCE-IA)制备  取无菌20ml注射器，将5％人体白蛋白注射液及5％葡萄糖注射液以1：3(4ml+12ml=16ml)抽吸入注射器，手动混合10秒钟之后，将注射器置于超声细胞震荡仪的超声探头下(图7-24)。

该注射器头端接三通阀，其一通道接含5ml C3F8气体的注射器。(按照物理学原理，1atm时，纯水中，电能转化为机械能约为90％，则Sonicator-XL 2020超声细胞震荡仪出厂功率650W，转化输出机械能总功率为600W。旋转能量输出钮至最大输出功率的25％，即

150W。垂直探头时，能量从呈弧状探头表面发射，弧度1.27cm，故计算出到达液面的超声能量约为120W/cm2)。调整超声探头使之接触液体表面，探头浸入液面深度为1.5倍探头直径时为宜。启动超声震荡仪，震荡100秒，其间通过三通阀匀速注入C3F8气体。

垂直静置注射器直至乳状微泡上液与下清液分离，弃去下清液。将乳状微泡液样本滴入红细胞计数板，光镜下检测。微气泡直径4.0～5.0μm，90％微气泡直径<7.01μm，浓度6.0×1000000000/ml，pH值6.5～7.0时为MCE-IA合格(图7-25)。

(五)超声仪技术参数  Sequoia 512电脑彩色超声系统仪，3V2超声探头频率2.5MHz。超声模式为心电图控制间歇式发射(intermitted triggered imaging, ITI)、间歇式二次谐波显像(second harmonic imaging，SHI)及瞬时反应成像(transient response imaging, TRI)等。间歇比值10：1心动周期，于R波中点连续触发2帧。机械指数(mechanical index, MI)>1.6，脉冲重复频率(pulse repeat frequency，PRF)2.5kHz，采用声学密度定量分析，能量组织多普勒(Angio)增益取总增益的50％。

(六)犬实验前准备  以3％戊巴比妥钠30mg/kg对犬实施静脉麻醉。洗浴后，胸、腹、腹股沟部、四肢脱毛。气管插管，呼吸机通气，潮气量20ml/kg。建立股静脉液路，行心电监护等备用于实验。

(七)冠脉急性闭塞及血运重建动物模型制作  于心导管室内，麻醉犬仰卧位固定。经右股动脉穿刺置入5F动脉鞘管，经动脉鞘管以100U/kg体重行肝素化处理。心电、压力监护下按照标准PTCA程序导引5F AL1导引导管达升主动脉，先以碘普罗胺370造影剂行选择性左右冠状动脉造影及右前斜30°左心室造影。右前斜30°导入Supersoft导引导丝至 LAD远端，然后依据冠脉直径导入U-pass(2.0～3.0)mm×10mm球囊至LAD第一间隔支以远处，试行以2～4atm扩张球囊，至能完全阻断LAD前向血流为度(图7-26，图7-27)。密切心电(图7-28)、血压和呼吸等生命体征监护下，持续堵塞血管90分钟以建立AMI动物模型。90分钟后回抽球囊，建立冠脉血运重建条件，并重复行重建后即刻选择性冠脉造影及左心室造影。于不同时相分别行心肌声学造影(方法同前)，影像资料输入自动工作平台待分析。

一般情况下，实施选择性冠脉造影及标准PTCA程序的成功率可达100％。但是在球囊加压扩张阻断LAD前向血流至8分钟和接近90分钟时，有发生室颤抢救无效死亡的可能。所以，冠脉闭塞后血运重建动物模型成功率约为70％。

(八)对照方法  在右前斜30°行左心室造影。观察左心室室壁运动状况，计算左心室收缩末期容积(left ventricular end systolic volume, LV-ESV)、舒张末期容积(left ventricular end diastolic volume, LV-EDV)，左心室射血分数(left ventricle ejection fraction, LV-EF)=(LV-EDV-LV-FSV)÷TV-EDV。

(九)心肌声学造影  于超声诊断实验室，麻醉犬涂电导液后实施心脏超声。取四腔心、左心室长、短轴超声切面，观察A时相(正常心肌)、B时相(球囊阻断左前降支冠脉过程中第30分钟)及C、D、E时相(LAD急性闭塞90分钟后血管重建即刻、血管重建30分钟及90分钟时)等5种时相心肌的超声心动图。分别于上述5种时相状态下，经股静脉以0.05ml/kg弹丸式注射MCE-IA，之后追加注射生理盐水4ml，以使MCE-IA足量进入冠脉管腔。启动ITI、SHI、TRI等超声模式，同一超声设置条件不变的情况下，于上述三种超声切面观察心肌声学显像超声心动图。超声影像学资料存入MO磁光盘，供脱机处理分析。

依笔者实验室的经验，5种时相心肌MCE灌注显像的声像特点如下：

A时相MCE心肌灌注显像特点(图7-29，图7-30)：经股静脉以0.05ml/kg弹丸式注入 MCE-IA后3～5秒，可见从右心至左心由稀疏至密集的心肌MCE-IA灌注回声。冠脉急性闭塞前的A时相，正常左心室心肌在10～20秒钟左右时回声达最强，50～60秒后回声开始减弱。MCE-IA彩色多普勒心肌灌注回声色泽鲜亮，呈亮黄色，在心肌内分布均匀，以心室前壁回声最强，侧壁后壁回声略弱。

冠脉闭塞及其血运重建后各时相MCE心肌灌注显像特点：B时相(完全阻断LAD前向血流过程中)，静脉注射MCE-IA后左心室前壁至心尖部心肌节段MCE-IA完全不显影而呈黑色，其周边可见环状缓慢而稀疏的不规则点状MCE-IA灌注回声区，使局部心肌呈现不均匀暗红色(图7-31)。

C时相(LAD开放后即刻)(图7-32)，可见左心室前壁至心尖部部分节段心肌缓慢出现 MCE心肌灌注回声，呈不规则点状，暗红色。

在LAD重建后30分钟及90分钟的D时相及E时相时，MCE心肌灌注较C时相无明显改善。

(十)病理学  冠脉血运重建后第90分钟获得E时相MCE心肌灌注图像后，电击处死动物，即刻取心脏，沿LAD走行旁开左室方向0.5cm纵向切开心室肌，肉眼观察心肌大体解剖。取含坏死、缺血及正常心肌全层标本置10％甲醛液固定，送光镜镜检及TTC(氯化硝基四氮唑)染色后分析心肌坏死面积。分别取上述三种生理、病理标本置2.5％戊二醛液固定，送电镜镜检。

大体解剖标本可见图7-33：左心室前壁至心尖部心肌区域性色泽变暗呈紫红色或黑红色。心肌坏死面积介于0.98～6.25(平均2.51±2.04)cm2，有时，与MCE心肌灌注图像异常区的面积相比较小，可能与MCE面积测于舒张末期，而电击处死动物心跳多停止于心收缩期等有关。

光镜(图7-34)及电镜下(图7-35)见局部心肌散在肌纤维束呈嗜酸性变，肌纤维纹理模糊或消失，核固缩或溶解，线粒体肿胀、增多，心肌间质微血管充血，血管内微血栓形成。

(十一)图像处理  从超声心动图获得的资料中，应用Angilent公司DSR-Manager软件，将MO磁光盘内动态图像转化为连续的单帧BMP格式图像并保存在计算机硬盘。采用TOM-TEC图像工作站，将图像回放，做左心室前壁兴趣区灰阶视频分析。

对左心室运动异常(wall motion abnormality, WMA)的定量分析：采用1996年美国超声心动图学会16节段半定量积分标准：将左心室划分为基段、中段和尖段，上述每段又分为前、下、侧、后壁及室间隔、前室间隔等共计16节段。

每节段室壁运动和增厚率均匀一致增加为正常，记1分。

收缩期室壁向内运动减弱为运动减弱，记2分。

收缩期室壁无向内运动或增厚为运动消失，记3分。

收缩期室壁变薄或向外运动为矛盾运动，记4分。

以室壁运动指数(wall mass systolic index, WMSI)评价左心室整体收缩功能，WMSI=每节段记分之和÷节段数×100％。有存活心肌定义为：至少2个相邻节段室壁运动改善，或基础状态下只有2个节段异常时，至少有1个节段运动改善。

一般情况下，冠脉闭塞前A时相节段室壁运动正常，室壁增厚率均匀一致：冠脉闭塞过程中第30分钟的B时相时，可见前壁、室间隔、心尖等节段心肌收缩期室壁向内运动减弱，局部室壁增厚率下降，WMA积分较A时相明显增高。而在血运重建即刻的C时相室壁节段运动进一步恶化，WMA积分较B时相进一步明显增高。A、B、C时相间可见随时间延长 WMA和WMSI增加的趋势。尽管冠脉血运重建达30分钟及90分钟，D、E时相的WMA及WMSI仍有逐渐增加趋势，但是以C时相作对照参数，其随时间增加而增加的趋势逐渐减弱。

心肌声学造影(MCE)评分：参考Porter等人的方法，以Angio能量多普勒的彩色定标对心肌MCE灌注显像的颜色和亮度进行目测评分：

心肌节段完全不显影而呈黑色得1分；心肌节段稀疏显影呈不均匀暗红色得2分；心肌节段部分显影呈不均匀橘红色得3分；心肌节段大部分显影呈较均匀橘黄色得4分；心肌节段完全显影呈均匀亮黄色得5分。

以触发间期(60×心动周期触发比率/心率，s)为横坐标，心肌节段灌注显像的目测评分为纵坐标，描画出该节段的MCE灌注显像的时间一强度曲线，并计算峰强度(peak intensity, PI)、峰强度减半时间(T1/2PI)。然后固定图像于左心室短轴乳头肌根部水平心舒张期末，即同步心电图R波起始部，以鼠标描记MCE心肌灌注缺损区范围，电脑声像系统仪可自动显示缺损区面积。MCE心肌灌注显像缺损区定义为：Angio能量多普勒彩色定标目测评分2分以下(含2分)。

MCE心肌灌注时间-强度曲线有如下特点：WMSI有随冠脉急性闭塞时间延长而逐渐增加的趋势，尤其在A、B、C时相明显。而MCE心肌灌注评分在冠脉急性闭塞的B时相最低(A时相：B时相=372:112，P<0.01)，冠脉重建即刻的C时相则有所增加，可能与直径4～5pm的MCE-IA微泡能够通过重建微小动脉，从而产生局部心肌声学影像改变有关，但其增加幅度极微，以致B时相至E时相MCE心肌灌注曲线几呈一水平线。

由MCE心肌灌注时间一强度曲线计算的PI及T1/2。MCE左心室心肌灌注显像PI以 A时相最强，与其后4个时相比较，有显著差异。而后4个时相之间PI几乎无变化。A时相T1/2PI为23.4秒，其后4个时相MCE-IA达峰时间缓慢，达峰后MCE-IA持续潴留在心肌组织内，致使T1/2PI>600秒。

MCE心肌灌注缺损区：将超声心动图图像固定于左心室短轴乳头肌水平左心室舒张末期，移动鼠标，描画出MCE心肌灌注缺损区，随实验时相延长，MCE心肌灌注强度与心肌灌注缺损区呈反比，伴随MCE心肌灌注强度的减弱而有心肌灌注缺损区的增加。

X射线心室造影左心室运动及左心室射血分数的对照参数分析：右前斜30°左心室造影显示，LA急性闭塞前A时相的左心室室壁运动正常，计算的LV-EF一般介于0.41～0.57(平均0.47 4±0.09)。LAD闭塞90分钟后冠脉重建即刻，即C时相再次左心室造影显示，左心室前壁运动减弱，部分左心室前壁及心尖部不运动。计算的C时相LV-EF介于0.29～0.42(平均0.34±0.07)，与A时相比较显著下降(P<0.05)。

LV-EF与MCE心肌灌注评分、MCE心肌灌注显影峰强度PI等呈正比例关系，而与左心室运动异常积分WMA、室壁运动指数WMSI等呈反比例关系，其间相关性密切。

模型评价

心肌存活性为目前心脏病学研究的热点，对冠状动脉血运重建措施具有十分重要的临床指导意义，只有存活心肌才能从血运重建中获益。随着选择性冠脉造影的广泛开展，人们逐渐发现完全闭塞的冠脉，其所属心肌可能由于得到充分的侧支循环供应而能长期存活：相反，AMI经血栓溶解或PTCA使相关冠脉完全再通后，所属心肌由于微循环重创而持续处于无血流或血流明显微弱状态。因此，发展定量心肌血流灌注和冠脉血流储备技术是近年来冠心病研究的新领域之一。目前，研究心肌存活性的方法很多。心肌声学造影(myocardial contrast echocardiography, MCE)是通过注射含有微气泡声学造影剂的方法使之灌注到冠脉微血管结构中，从而使含血心肌的超声心动图显像增强。21世纪伊始，MCE便取得突破性进展，新一代声学造影剂的发现及超声显像技术的发展使经静脉注射声学造影剂导致左心室心肌显像成为可能。从而可以直接反映冠脉微循环状况、确定急性心肌梗死的危险区、评价心肌存活性及冠脉血流储备。

理想的心肌声学造影剂应具备以下特性：①无生物活性；②低血液溶解度、低弥散度的大分子量气体；③不影响正常冠脉血流；④要有足够长的半衰期(至少30秒至数分钟)：⑤能使左心室心肌充分显影。依据1995年Porter及其同事报道的方法，本模型首先试行研制了可经静脉注射并能通过肺循环使左心室心肌显像的氟碳声学造影剂MCE-IA。结果显示，经静脉以0.05ml/kg弹丸式注入自制的MCE-IA，在实验犬获得良好的左心室心肌灌注显像，显像成功率100％。与普通超声心动图对照，左心室心肌MCE灌注显像呈色鲜艳，空间分辨率高。正常左心室心肌MCE开始显像时间为3～5秒，显像达峰时间平均为10～20秒，峰平台期持续50～60秒，峰强度减半时间平均为23.4秒。足以提供充分的时间和清晰的图像供作对照性实验研究。由于该方法安全无创，可在床旁实施，并可在短期内多次重复进行，而具有较大的临床实用价值。

实验通过闭塞犬LAD然后血运重建，造成犬心肌微循环灌注及肌存活性五种不同生理、病理时相，相继研究其MCE心肌灌注显像。

结果证明MCE心肌灌注显像能精确显示心肌微循环灌注状态，与同时检测的超声学心肌运动异常评分WMA及室壁运动指数WMSI具有良好的相关性，与同时左心室造影检测的左心室射血分数亦具有密切相关性。超声心动图显示的MCE心肌灌注缺损区面积与 MCE心肌灌注峰强度以及大体解剖学心肌坏死面积密切吻合。

与冠脉闭塞时对照，冠脉重建后的MCE心肌灌注显像增强，可能与直径小于7.0μm的MCE-IA徼泡通过重建的微小动脉，使局部心肌声学显像改变有关，但是由于其改变量微小，而不影响MCE诊断心肌微循环灌注的精确性。另外，犬冠脉循环存在丰富的交通支，也是造成阻断冠脉血流后局部心肌仍有微量散在MCE显像的原因之一。

因此，21世纪伊始发现的可经静脉注射、并通过肺循环使左心室心肌显像的MCE-IA开辟了无创性评价冠脉微循环灌注及心肌存活性的新途径。本模型利用自制MCE-IA左心室心肌灌注显像率可达100％，并具有清晰的空间分辨率。对犬冠脉急性闭塞及重建后心肌微循环和心肌存活性的诊断精确性、可信性与同时左心室造影和心肌大体解剖、镜下所见密切相符。可以作为研究心肌缺血后再灌注/无复流的优良动物模型。