土拨鼠(marmota monax, 英文名groundhog)也叫旱獭。土拨鼠平均体重为4.5kg，最大可成长至6.5kg，身长约为56cm。土拨鼠主要分布于北美大草原至加拿大等地区，与松鼠、海狸、花栗鼠等皆属于啮齿目松鼠科。

动物乙肝病毒包括土拨鼠肝炎病毒(WHV，仅感染美国东北部的东方土拨鼠)，地松鼠肝炎病毒(GSHV)和北极松鼠肝炎病毒(ASHV)。经序列测定表明：WHV和GSHV两种病毒间的核苷酸与氨基酸序列之间差异很小，其变异度不大于人类不同HBV亚型之间的序列变异。由于WHV与HBV在基因组构成方面的相似度大于禽类肝炎病毒，可以在天然宿主体内研究病毒的整个生活周期，因此土拨鼠模型也是目前在HBV研究中应用最广泛的模型。

土拨鼠肝炎病毒是东方土拨鼠(图10-3)体内自发感染的一种病毒，该病毒最初于1977年在费城的佩罗斯公园被发现可以引发土拨鼠的慢性肝炎和肝癌。目前，已经分离到了几株WHV病毒，其基因型较为接近，但是对新生土拨鼠感染后，可引起不同程度的慢性肝炎。土拨鼠肝炎模型是研究HBV感染和抗病毒治疗研究中应用最为广泛的模型之一。

1980年康奈尔大学将土拨鼠种群培育成实验室模型。早期的模型研究进展包括：①生产和验证用于WHV检测的试剂和方法，确定疾病标志物；②对新生土拨鼠进行WHV接种，确定该感染会导致较高的慢性肝炎发病率；③对实验感染的成年和幼年土拨鼠进行病毒学和肝癌自然发生的研究。1988年后，新生土拨鼠WHV模型开始应用于抗病毒感染的核苷酸类似物检测。

早期研究中，土拨鼠模型也曾被用来检测传统的抗病毒疫苗对成年和新生土拨鼠急性、自限性WHV感染的预防效果，以及对已经免疫的新生土拨鼠进行免疫，进而检测疫苗对慢性肝炎和肝癌的预防效果。使用免疫抑制剂——环孢素A，研究急性和慢性感染中的免疫调节，以确定宿主的免疫系统在WHV感染的自限与慢性转化中扮演的角色。自20世纪80年代以来，土拨鼠肝炎病毒的研究主要集中于模型建立和模型应用，其中包括病毒感染及疾病病理，抗病毒药物筛选，单独或系统性的免疫调节。主要内容如下：

(1)WHV感染和疾病的自然发展：土拨鼠肝炎病毒模型是被研究者们广泛接受的应用于研究人乙肝病毒感染的模型。最近关于土拨鼠对WHV感染反应的研究，揭示了WHV感染的一系列免疫机制。土拨鼠病毒感染中的免疫标记物，与人和小鼠感染后并不完全相同。但是，土拨鼠感染过程中，免疫反应的类型和强度与人乙肝病毒感染过程高度相似。

分别对成年或新生的土拨鼠感染WHV后，会导致相应的急性感染转自限性，及发展为慢性感染两种类型，这一点与人的年龄对HBV感染结果的影响一致。对成年土拨鼠进行 WHV感染，大部分会发生自愈，约有5％发展为慢性肝炎(图10-4)。但是，在对成年土拨鼠进行接种病毒及急性感染期间，用环孢素A暂时抑制细胞免疫，可导致92％的感染发展为慢性携带者。仅在接种期和急性感染的早期(0～4周)注射环孢素A，则有50％的感染发展为慢性携带者。

绝大多数WHV慢性感染来源于新生儿的获得性感染。对新生土拨鼠进行病毒感染，有60％～75％的概率发展为慢性携带者(图10-5)，而25％～40％能自行恢复。在春季对新生土拨鼠进行感染时，病毒载量与宿主的免疫反应较为一致，因此其随后一年内采集的样本可以用于数据建模，来分析血清学和肝脏的变化。这些特点也使得该模型可以同时用来检测自限之前的急性感染期的宿主反应，以及转化为慢性感染后的血清学特征。从而可以确定和区别导致自限与慢性感染的机制。

慢性WHV感染会导致长期的病毒复制，从而导致慢性肝病或肝癌。在慢性WHV感染的土拨鼠体内，没有自然发生的从e抗原到血清中e抗体的转变以及随后的病毒复制逐步下降，而这一点在人的乙肝感染中较为常见。一般来说，慢性WHV携带土拨鼠体内的大量病毒复制，极高的表面抗原和e抗原载量，对于保持宿主的免疫耐受，从慢性肝病到肝癌的发展十分重要。

在自限性WHV感染中，病毒复制基本上被抑制，体内病毒完全被清除。然而，在早已经自愈的土拨鼠体内，能在肝脏、血清和外周单核细胞内检测到痕量的WHV基因组，这也可能是另一种意义上的持续感染。同样，被HBV感染后自愈的人体内，也能检测到痕量的 HBV DNA。与血清水平阴性(未被WHV感染)的土拨鼠相比，感染后自愈的土拨鼠依然有5％～20％的概率患上肝癌，但是，与慢性感染的土拨鼠相比，这个概率已经很低(后者是100％)。该结果使得慢性WHV导致肝癌的现象可以与慢性HBV患者与肝癌进行对比。

近期，有学者对感染WHV并自愈的土拨鼠使用了CsA来抑制免疫系统反应，研究 WHV病毒复制的激活，发现肝脏和外周血中残留有WHV DNA或者病毒抗原的土拨鼠，在 CsA处理期会有短暂的WHV恢复，这可能是因为病毒被宿主的病毒特异性的免疫反应压制，从而维持在较低的复制水平。宿主细胞免疫反应的长期记忆与低水平的病毒复制之间的相互作用，对于长期的稳定控制病毒复制和压制感染过程，从而维持在恢复期十分关键。对于慢性HBV或WHV感染的抗病毒或者免疫治疗，应该借鉴自然感染状态下恢复期的免疫状态。

(2)病毒的分子生物学研究：WHV属于肝病毒科，正肝病毒属，WHV的基因构成与 HBV及其他哺乳动物的肝病毒类似，生物学特性和复制方式也基本相同。在WHV感染的土拨鼠血清内，包膜蛋白(WHsAg表面抗原)构成了线性或球形的颗粒，完整的病毒粒子直径为42～45nm。病毒内部含核蛋白或称作核心蛋白(WHcAg)以及DNA基因组。WHV与HBV的复制循环相同。在部分研究中，WHV的基因组曾经被克隆、酶切并环化成超螺旋DNA，并将其注射到土拨鼠的肝薄壁中，从而导致了WHV感染。

HBV进入肝细胞的感染过程机制未明。研究表明，位于大包膜蛋白的pre-S1区的特异序列可能负责全部或部分的病毒与细胞的相互识别，但是到目前为止，HBV的肝细胞受体还没有被完全确认。然而，单抗的体内中和试验揭示了越来越多的包膜蛋白其他部位的识别位点，且仅由小包膜蛋白制备的疫苗即能发挥有效的保护作用。病毒进入细胞后，部分双链的环状DNA进入细胞核中，在此经内源性的与病毒颗粒相连的反转录DNA聚合酶变成完整的双链DNA，然后完整的双链DNA连接成共价、闭合环状的cccDNA。在细胞内 RNA聚合酶Ⅱ的作用下，cccDNA作为病毒mRNA转录的模板。一种mRNA转录产物(稍大于病毒基因组)与病毒聚合酶一起整合入成熟的核心抗原粒子中，在此，在病毒聚合酶的RNA依赖的DNA聚合酶酶活性催化下，反转录出一条负链DNA。然后，病毒利用自身的DNA依赖的DNA聚合酶活性，合成一条约相当于负链长度50％～75％的正链DNA。在成熟的WHV与HBV病毒颗粒中，均发现了此类非闭合环状的双链DNA。包膜蛋白在细胞的内质网上合成，随后成熟的病毒颗粒从肝细胞中释放出来。乙肝病毒自身对于感染的细胞并没有毒性。

在HBV中，对于核心抗原的免疫染色，绝大多数见于核中，而在WHV中，大部分的核心抗原染色均见于细胞质中，在细胞核中没有发现。这表明新合成的细胞质核心抗原负责反转录，部分或全部的正链DNA合成，以及偶尔的重新进入细胞核而合成cccDNA。在 HBV中，细胞质内的核心抗原低于检测水平(免疫染色)，浓密的细胞核内核心抗原染色预示着核心抗原在此成熟。然后，成熟的核心抗原通过另一种细胞途径抵达内质网，并组装表面抗原。在已经建立的土拨鼠慢性WHV感染模型中，与人的HBV慢性携带者相比，其WHV颗粒的浓度是后者的10～100倍。这可能与两者间核心抗原的不同免疫定位相关。

在WHV的复制周期中，DNA到RNA的转录过程与反转录病毒类似，但是没有把DNA整合入宿主的基因组。感染的肝细胞内游离的cccDNA是稳定的，将它从系统内消除需要将被感染的细胞清除，因此，它是宿主清除乙肝病毒的主要目标之一。当乙肝病毒的DNA进入细胞的基因组时，DNA要截断并进行重排，并且可以插入细胞基因组的任何位置，这对于肝细胞的癌化十分重要。对肝脏的形态学和病毒学研究表明，在WHV感染的土拨鼠中，100％的肝细胞都被病毒感染。虽然急性感染康复后，病毒的中间体均被清除，但是cccDNA在病毒复制停止后依然会存在很长的时间。

(3)免疫学研究：对新生和成年的土拨鼠进行WHV感染后，其恢复均需要肝脏和周边环境中针对病毒的特异免疫反应来清除病毒。自然恢复过程是对慢性感染进行抗病毒或免疫治疗的基准。许多研究表明，诱导特异的细胞和体液免疫反应是成年病人中HBV清除的前提。与人类患者相比，人在感染HBV之后，多数情况下并没有明显的临床症状，所以在成人感染HBV的潜伏期与急性感染期，免疫反应的发展及其对感染的影响和在清除感染中的作用还没有得以深入研究。

普遍认为HBV是嗜肝病毒，但是HBV的DNA可以在肝以外的其他组织检测到。DHBV可以在鸭的胰腺中复制。HBV和WHV可以感染淋巴系统，这种现象目前还无法理解。部分研究表明，WHV在淋巴组织中的复制与扩散甚至可以发生在肝脏的感染之前。使用脂多糖对慢性WHV携带土拨鼠的外周血单核细胞进行刺激，可以使得其中静态的DNA激活并形成复制中间体。脂多糖对慢性WHV携带土拨鼠的外周血单核细胞进行刺激后的无细胞上清，可以感染敏感的成年土拨鼠，并引发急性感染。

淋巴组织中的WHV基因组是处于静止还是复制状态，取决于宿主的淋巴细胞所处的状态(如休眠，分裂，血液中循环和淋巴组织内部)。对新生土拨鼠进行WHV感染后，一个月后即可在骨髓中检测到WHV的DNA，但是，在外周血单核细胞、淋巴结和脾中WHV最初的复制标记物出现是在急性复制期。在感染后的康复期，淋巴组织中WHV复制趋向静止状态(或完全消除)。在慢性感染中.外周血单核细胞中的WHV复制同样处于静止状态.但是经常在脾中复制，且外周血单核细胞中静止期的WHV可以被体外的脂多糖刺激所激活。越来越多的近期研究表明，从急性感染中恢复的土拨鼠外周血单核细胞中，同样存在有感染性的WHV的DNA。

综上所述，无论是从急性感染期恢复，还是慢性感染的土拨鼠，其外周血单核细胞中的WHV感染状况类似，在上述两种情况下，用ConA、PHA和LPS等有丝分裂原刺激时，外周血单核细胞的明显增加。淋巴系统的感染对于病毒引发的免疫反应没有产生影响。实际上。无论是在急性还是慢性WHV感染的土拨鼠中，均没有导致淋巴结肿大、淋巴球减少、淋巴瘤和全身性免疫缺陷引发的机会感染。与自然恢复结果一样，对慢性WHV的治疗要注重淋巴组织和肝脏中的所有病毒库和各种复制形式的病毒。

对自限性WHV的研究，揭示了其多种与人HBV自限性感染相关的免疫类型。一般说来，新生与成年土拨鼠的自限性感染均具有下述特点：①在急性感染期，可以在肝脏和血清中检测到病毒的DNA及抗原的高峰期；②针对抗原的快速细胞免疫反应；③急性病毒肝炎但是肝损伤轻微；④血清中转氨酶活性出现一个短暂的高峰，随后趋于正常；⑤血清中出现病毒的中和抗体，这些会导致血液及肝脏中的病毒及病毒抗原清除。康复期对病毒抗原的体液免疫具有下述特点：在急性感染的开始及衰退期(一般在实验室感染后数周内发生)，产生高效价的抗核心抗原抗体。及具有中和保护活性的抗表面抗原抗体。

在成年土拨鼠中，细胞介导的免疫包括对外周血单核细胞的激活，这一点已经在体外通过WHsAg、WHcAg和两种抗原的合成肽刺激外周血单核细胞而得到证实。外周血单核细胞对WHcAg的成功反应与病毒在血清中的清除相偶联，而这些与WHcAg的几个关键抗原位点相关。与没有免疫的土拨鼠相比，使用WHcAg抗原的主要抗原决定簇区域(97～110位氨基酸)对成年土拨鼠免疫后，再进行WHV感染时，会减弱急性感染反应。而急性感染恢复期内，外周血单核细胞对WHsAg和WHXAg的反应，尚在研究中。

新生土拨鼠的WHV感染急性期内，细胞介导的免疫反应与成年土拨鼠的情况类似，与使用的病毒接种物无关。对病毒抗原健全的外周血单核细胞反应，对清除血清内病毒DNA和WHsAg至关重要。对WHcAg引发的免疫反应的详细研究，揭示了这一抗原上部分特异的抗原决定簇。与成年土拨鼠感染类似，新生土拨鼠也对WHcAg抗原的主要区域产生反应(97～110位氨基酸，100～113位氨基酸)。

在肝脏内，自限性成年土拨鼠感染的特点：从温和到明显的肝炎症和损伤，CD3+的T细胞积累以及肝细胞的凋亡和再生。

(4)抗病毒药物：土拨鼠乙肝模型的研究工作，提供了各种影响病毒感染、复制和慢性携带的因素。由于WHV和HBV的DNA聚合酶生化性质的类似，可以应用土拨鼠模型来评价抗病毒药物。应用此模型，学者们评价了大量的核苷酸类似物药物和其他抗病毒化合物。在土拨鼠模型中发现，使用抗病毒药物非阿尿苷进行6周的治疗后，此药物具有长期毒性，引起肝功不足和乳酸性酸中毒。这一症状与临床使用非阿尿苷治疗所引发的致死性毒副反应类似，表明土拨鼠可以用来对乙肝类抗病毒药物进行临床前评价。然而，在大规模的药物筛选中，土拨鼠仍然难以克服自身不易操作和价格昂贵的缺陷，难以普及使用。

在猪之间流行一种肝病毒科的病毒，该病毒被命名为猪乙肝病毒(swine hepatitis B virus, SHBV)。SHBV可以用临床检测人乙肝的试剂盒(ELISA试剂盒)、免疫组化和电镜检测到。对感染了SHBV的猪进行检测，其中24.8％可以检测到HBsAg和 Anti-HBsAg，而几乎检测不到e抗原和e抗原抗体。肝脏样品用免疫组化检测到了表面抗原和核心抗原。肝实质区细胞发生点状变形、坏死，纤维结缔组织激增。透射电镜下，在肝细胞的核区可观察到类似于HBV颗粒，分为20nm和40nm的颗粒，分别和HBV的球形和 Dane颗粒对应。

猪作为实验动物，具有其他HBV易感动物不可比拟的优势。猪在医学研究中应用广泛、来源充足。因此，猪乙肝模型的深入研究，有助于推动HBV感染的病原学和免疫学研究，有望在将来成为较为普遍的HBV模式动物。