近交系动物既是动物分子遗传育种研究的标准化遗传学材料及基础群，也是医学生物学研究的标准化动物及研究材料。近交系动物的研究和利用，开拓和解决了哺乳动物遗传、发育、生理等多方面的诸多新难题，对生物学、生命科学尤其是人类医学的发展起到了不可估量的作用。但是近交繁育极为困难，而近交及其遗传稳定性在动物资源保存中具有独特作用。因此，开展近交系动物资源评估、利用与研究，可从资源上保证动物分子遗传育种研究的持续发展。

中国地鼠属啮齿目、鼠科、仓鼠亚科的动物。中国地鼠是我国黄河以北一些省份的优势鼠种，已为细胞遗传学、辐射遗传学、实验肿瘤学和分子生物学等许多领域所应用，在医学和生物学等实验研究中，占有重要的地位。山西医科大学薄家璐等人在1980年春，从北京郊区农田捕获中国地鼠60只进行驯化培育，现保持存笼中国地鼠3000只左右，成为我国唯一庞大的中国地鼠群体。并于1991年在实验室培育成功中国地鼠近交系，定名为SYB1(A家系)，“山医群体近交系中国地鼠”已被英国学者Michael等收入“实验动物国际索引”。1982年引进的被命名为E家系。但是这一源于我国的实验动物资源——中国地鼠的生物性状、基因组等基础资料报道甚少。为了使山医群体近交系中国地鼠这一极具研究价值的实验动物资源得到保护、开发和广泛应用，我们对山医群体中国地鼠采用RAPD技术进行遗传检测，对中国地鼠山医群体A、E家系的遗传结构进行分析，旨在为以后进一步选育和相关研究提供依据。

一、材料与方法

1.试验材料  本文共分析了山西医科大学实验动物中心培育的中国地鼠近交A、E两家系，各家系随机取12只。1～12号为A家系，13～24号为E家系。各家系均取中国地鼠尾巴1cm左右作为实验材料提取DNA。每个个体都有完整的系谱记录。

2.基因组DNA提取  将鼠尾置于1.5ml离心管中，每管加入500μl的裂解液TNES[TNES成分：10mmol/L Tris，pH7.5，400mmol/L NaCl，100 mmol/L乙二胺四乙酸钠(EDTA)，0.6％十二烷基硫酸钠(SDS)]和35μl的蛋白酶K(10mg/ml)消化。按常规酚、三氯甲烷、异丙醇抽提，溶于适量TE缓冲液溶解，检测DNA浓度，调整至50ng/μl，－20℃保存备用。

3.引物筛选  本实验共对100条随机引物进行筛选，引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成。用中国地鼠山医群体个体初筛，对产生多态性好且扩增稳定的引物，换用不同家系模板进行8次筛选，选取在多次扩增中重复性好的30条引物，用于本实验中所有供试中国地鼠组织DNA的扩增。引物号及序列见表4-3。

4.PCR扩增与电泳  PCR反应在PTC-100TM(MJ Company USA)进行。反应总体积25μl，其中MgCl2 2mmol/L，dNTP 200μmol/L，10×buffer 2.5μl，Taq酶1.5U，引物15ng，DNA 50ng左右。PCR反应程序为94℃预变性3min后进入循环体系，94℃变性30s，36℃退火50s，72℃延伸1min，40个循环，最后72℃延伸7min。将扩增产物于含有溴乙锭(0.5μg/ml)的1.5％的琼脂糖凝胶中电泳，电泳结果用UVP凝胶分析仪观察并拍照存盘。

5.统计分析方法  对凝胶成像系统记录的RAPD图片，将每一引物扩增每一样品产生的每条带作为性状看待，当在某一样品中有该带出现时记为“1”，否则为“0”，统计实验结果。遗传距离指数D＝1－F，其中F＝2Nxy/(Nx＋Ny)，Nx和Ny分别为两个体x和Y扩增的总带数，Nxy为两个体x和Y共有带数。平均相似系数(F)通过对个体间的相似系数简单平均求得。某群体平均遗传距离指数为该群体内所有个体的任意两个遗传距离指数的平均值。任意两个群体间的平均遗传距离指数为一个群体内的任意一个体与另一群体间遗传距离指数的平均值，所有个体间的遗传距离指数均参与计算。聚类分析：运用SPSS11.0对各家系进行聚类分析并构建聚类关系图。用ward Method法对数据进行聚类分析。

二、结果

1.随机引物扩增结果  用30条引物共扩增出255条带，即检测了24只中国地鼠的255个位点，其中多态性条带45条，多态性条带频率在0～76.9％之间，平均为17.6％。在山医群体中国地鼠不同家系以及同一家系不同个体间，可检测到不同扩增带型。扩增情况见表4-3。部分扩增图谱见图4-4和图4-5。

2.中国地鼠各家系内和家系间各个体间相似系数和遗传距离  应用30条引物对山医群体中国地鼠A家系、E家系家系内随机抽取样品进行扩增，根据RAPD谱带计算不同个体间的相似系数(F)和遗传距离(D)(表44、表4-5、表4-6)。从表4-4所列数据看，A家系中国地鼠的相似系数在0.9169～0.9916之间，平均相似系数为0.9749。从表4-5所列数据看，E家系中国地鼠的相似系数在0.9431～0.9978之间，平均相似系数为0.9549。从表4-6看出，A家系和E家系间相似系数为0.9241～0.9786，平均相似系数为0.9506。

3.聚类分析  从聚类图上可看出(图4-6)，A家系1～12号样品先聚为一类，E家系13～24号样品聚为一类，然后这两大类再聚在一起。

三、讨论

1.RAPD在群体遗传分析中的特点  RAPD的遗传多态现象比较复杂，在利用 RAPD进行群体遗传学研究时，绝大多数条带被当做显性标记来处理。其中，PCR扩增阴性主要是由于引物结合位点发生了突变导致不能形成稳定的引物一模板复合物，或者引物结合位点之间的DNA片段长度变异超过了PCR的扩增范围(2～3kb)所致。从理论上来说，条带的浓度本可以反映显性纯合子与杂合子之间的差异，然而由于精确控制PCR反应条件极其困难，事实上无法以此确定扩增阳性条带的基因型是显性纯合还是杂合。这使得将RAPD这一类显性标记运用于群体遗传分析中时的数据处理与解释比较复杂，根据它们得到的结果比共显性标记如等位酶或微卫星分析要损失一定的信息。

2.中国地鼠的遗传纯度  从RAPD结果来看，山医群体两家系内及家系间的平均相似系数分别大于0.9169、0.943 1和0.9241，家系间的遗传距离只有0.0494，显示整个山医群体中国地鼠的遗传变异小，遗传纯度高。这与山医群体两家系形成过程中的单一选择与长期近交有直接关系，导致群体遗传多样性变异较小。A家系的相似系数比E家系低，可能在近交过程中由于工作人员将动物编号弄错，动物的谱系图和实际的动物亲缘关系不一致，近交系繁育不能严格按照近交繁育交配方式进行，存在遗传污染的问题，即一个近交系与非本品系动物之间杂交引起遗传改变，没有及时进行遗传检测，将已发生遗传污染的动物淘汰，导致部分个体与其他个体的亲缘关系疏远。

3.关于应用RAPD进行品种遗传关系分析时的引物数目  RAPD技术的引物种类很多，运用上百种引物，可以对整个基因组进行地毯式多态分析，两个基因组之间的微小差异也能被反映出来。因此，在RAPD扩增中，引物的数量也是决定 DNA聚类结果可信度的一个因素，引物越多，基因组DNA上被探测的位点越多，结果越真实可信。由于不同引物G+C含量与被测基因组G+C的含量间存在差异，当引物中G+C的含量接近于基因组G+C含量时，扩增的DNA片段最多，反之极少。因此，采用RAPD分析动植物品种间遗传关系时，必须使用一定数量的引物进行PCR反应，以便分析结果客观、准确。本研究从100条引物中筛选出的30条引物，其多态性主要分布于A家系和E家系之间，A家系间表现多态性的仅占18.2％，说明所研究的群体亲缘关系愈近其基因组间的保守性愈强，欲通过RAPD标记的多态性反应群体间的遗传关系，就必须使用足够数量的引物。在中国地鼠 A家系和E家系RAPD及其遗传关系的研究中，作者发现用10条引物所产生的数据进行聚类分析时开始出现种内不同个体各自相聚现象，当引物数增多到第20条，聚类图中种内不同个体仍紧密相聚，种间亲缘关系未发生改变。本实验中，我们在输入8条引物的数据时，不同种群的个体开始相聚，增加到第30条引物时，种群间不同个体仍聚在一起，种群间亲缘关系也未发生改变，这在一定程度上说明在 RAPD分析中需足够的引物数量产生可信的聚类结果，同时研究相似性较高的种群关系比区分相似性较低的种间关系需要更多的引物进行多态位点的比较分析。

RAPD图谱显示，同一种群不同个体之间的扩增谱带存在不同程度的差异，而从图4-6中可以看出，同一种群不同个体首先相聚，然后与其他种群聚在一起，说明本研究所建立的RAPD扩增体系适用于种群间的亲缘关系研究。在RAPD技术问世初期，该方法便很快应用于动植物、微生物不同品种、品系及株的鉴别。之后 RAPD技术在种下不同种群及近缘种亲缘关系的研究中仍发挥着重要作用。