一、材料与方法

1.实验动物  山西医科大学实验动物中心培育的中国地鼠，随机取48只地鼠作为研究对象。取尾巴组织作为实验材料。

2.试剂配制

(1)40％丙烯酰胺贮备液(39：1)：将195g丙烯酰胺和5g N,N'-亚甲双丙烯酰胺溶于400ml水中，37℃水浴助溶，加水定容至500ml。棕色瓶4℃保存。

(2)10％过硫酸铵：将1g过硫酸铵溶于10ml水中，混匀，4℃保存数周。

(3)13％聚丙烯酰胺凝胶：量取19.5ml 40％丙烯酰胺贮备液、12ml 5×TBE、27.874ml双蒸水于一三角瓶中，混匀，再加入0.6ml 10％过硫酸铵和26μl TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二胺)，充分混匀。

(4)DNA变性缓冲液：在98％的去离子甲酰胺中加入EDTA(pH8.0)至终浓度10mmol/L，二甲苯青FF至终浓度0.025％，溴酚蓝0.025％。

3.引物设计  根据微卫星文库阳性克隆的测序结果，用phred/phrap/consed等软件进行拼接处理，根据微卫星重复序列两侧的保守侧翼序列用primer3.0批量设计引物，共得到135对引物，部分核心序列及侧翼序列见表5-9，筛选PCR片段在100～300之间的引物。进行订购。普通引物由北京擎科生物有限公司合成。带荧光标记的引物由上海生工生物公司合成。

4.初步筛选多态性的微卫星引物

(1)PCR扩增

①稀释引物：稀释引物前先离心，以把悬浮的引物颗粒甩到管底，向每孔加入适量的ddH2O，稀释成100μmol/L的贮存液，再从中取出1μl稀释100倍至工作浓度1pmoL/L。

②用单个模板做所有引物不同温度下的PCR

体系如下：

DNA(20ng/μl)         0.8μl

10×buffer(Takara)    1.0μl

Mg2+(25mmol/L)        0.8μl

dNTP(2.5mmol/L)       0.8μl

primer-F(100μmol/L)  0.001μl

primer-R(100μmol/L)  0.001μl

Taq DNA聚合酶(5U/μl) 0.1μl

ddH2O                  6.5μl

总体积                 10μl

扩增程序：94℃预变性5 min

94℃变性30s

（45～62℃退火30s、72℃延伸45s、72℃延伸20min）35个循环

③经过反复优化筛选，然后做28个个体混合物的PCR，得到一系列引物适合的扩增条件。

注：先用单个个体进行PCR，因为这样可以得到一条单一的条带，如果得到了多条条带，说明是非特异性扩增，舍去。然后用混合DNA库的PCR，以看其多态性。

(2)聚丙烯酰胺凝胶电泳：根据分离DNA片段的大小及需要凝胶的容积，配制浓度12％聚丙烯酰胺凝胶，体系见表5-8。

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后采用12％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳初步检测扩增产物的多态性。具体步骤如下：

①将电泳玻璃板及间隔片用洗涤剂清洗、自来水冲洗、双蒸水冲洗、超净台中晾干。使用前用无水乙醇擦拭，晾干。

②按要求将玻璃板、间隔片等模具组装好并夹紧，两块玻璃板的两侧及底部用1％的琼脂糖封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液出。

③根据实际需求配制所需体系，表5-8。混匀后缓缓倒入两玻璃板间的胶床中，直到液体接近溢出时为止；灌胶时要注意保持连续性，并避免产生气泡。

④将梳子从一端缓慢插入，避免产生气泡。室温下聚合1～2h。

⑤小心取出梳子，立即用缓冲液冲洗加样孔，因为梳子取出后，梳子上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合，产生不规则的表面，将导致以后DNA电泳带型不规则。将胶板安装到电泳槽中，夹好夹子。在电泳槽中倒入1×TBE电泳缓冲液，液面要没过梳子。

⑥接通电源线，打开电泳仪，60V恒压电泳预电泳20～30min。

⑦将DNA样品与适量的载样缓冲液混匀后，取10μl PCR产物加到样品孔内，加样时不要产生气泡。

⑧接通电源线，打开电泳仪，90V恒压电泳4h。为避免凝胶升温导致条带弯曲，将电泳槽放入4℃冷库中。

⑨待溴酚蓝跑出凝胶时终止电泳。

⑩电泳完毕，切断电源，弃去电泳仪，取出胶床板，小心移去玻璃板，把凝胶浸入含0.5μg/ml的Goldview溶液中，5min后取出，紫外仪下观察结果。

5.筛选用荧光标记多态性好的引物  根据PAGE结果，选取多态性好的引物并在正向链的5'端进行蓝色(FAM)荧光标记。随机选取48个个体，提取DNA并进行定量，模板浓度稀释为10ng/μl做PCR。

PCR反应体系如下：

DNA(10ng/μl)               0.8μl

10×聚合酶缓冲液(Takara)    1.0μl

Mg2+(25mmol/L)              0.8μl

dNTP(2.5mmol/L)             0.7μl

正向引物(100μmol/L)        0.001μl

反向引物(100μmol/L)        0.001μl

Taq DNA聚合酶(5U/μl)       0.O8μl

ddH2O                       6.6μl

总体积                      10μl

热循环系统如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，62℃(依引物确定)退火30s，72℃延伸45s，30个循环后72℃补齐7min。电泳检测。

根据不同的扩增效率移取3～5μl PCR反应液至一新的384孔板中，每孔加入95％的乙醇醋酸铵混合液(30：1)，乙醇醋酸铵混合物与测序产物的比例约为3：1，使乙醇的终浓度为70％，混匀放在－20℃冰箱中冷却20min，4300r/min，4℃，离心30min；弃上清，倒扣在吸水纸上放入离心机倒甩至500r/min；每孔加入33μl 70％的乙醇，混匀，4300r/min，4℃离心15min，倒扣在吸水纸上放入离心机倒甩至500r/min；避光晾干，约20min，加入加有内标GeneScanTM-500 LIZTM(Applied Biosystems, Inc.)的loading buffer(去离子甲酰铵)8μl，上机荧光扫描。

6.数据处理  荧光扫描结果用GeneMarker V1.6(Applied Biosystems, Inc.)进行基因型判读；用mierochecker、MStools检查数据的准确性，检验亚等位基因(null allele)、影子带(stutter)以及大等位基因的遗失扩增(1arge allele dropout)；用FASTA计算等位基因丰富度，进行位点间独立性检验等多种参数；用MStools计算PIC、 Ho、He等；用genepop计算样本的哈迪-温伯格平衡。

二、结果

1.基因型判读结果  用荧光标记的引物进行PCR扩增，移取适量PCR产物进行纯化，以GeneSeanTM-500 LIZTM作为内标，在ABI3730 DNA测序仪上(Applied Biosystems, Inc.)进行STR扫描，然后通过GeneMarker V1.6(Applied Biosystems,  Inc.)进行基因型判读，示例图见图5-8，上图为杂合子，下图为纯合子，峰形匀称，无杂峰，且能看出明显的多态。

2.引物筛选统计结果  经过富集文库构建与对引物多态性的筛选，得到17对PIC较高的微卫星引物，现将其引物序列、重复类型、退火温度、荧光标记、扩增产物大小、观察杂合度与期望杂合度、多态信息含量以及各位点的等位基因数目等参数总结如表5-9。

三、讨论

1.SSR引物的设计  本研究利用筛选出的微卫星位点用Primer3.0在线批量设计引物。引物设计的好坏对引物与模板的特异结合有很大影响，所以对设计的引物要充分评估，筛选引物过程中发现SSR引物应该具备以下几个原则，比较容易扩增。

(1)选择引物长度20bp左右，产物的长度为100～300bp。

(2)引物Tm在55～65℃之间(Toth, et al. 2000)，常用经验公式：

Tm＝2(A+T)+4(G+C)[(A+T)、(G+C)指碱基的个数]来换算；合成引物时，报告单上也会有Tm值；软件(典型的如PRIMER-MASTER)也可以对引物Tm进行计算。

退火温度有下面计算公式来确定：Tm＝0.3Tm(引物)＋0.7Tm(PCR产物)－14.9；退火温度应低于Tm，退火温度越高，特异性越高。

(3)通过延长Tm低的引物，保证两个引物的Tm相差不超过4℃；(G+C)％含量近似(45％～55％)。

(4)3'端引物无发夹结构，如果模板不很清楚，3'端最后一个碱基T，G或C，不选A引物；如果模板很清楚，选A提高特异性；两引物3'端应保证无互补配对。

2.荧光标记引物  荧光标记引物的寿命比一般引物较短，只有1～2年的保存时间，而且保存方式也会影响荧光引物的寿命。荧光标记引物最好在－20℃高浓度避光保存，而且引物也要避免反复冻融。分析结果时，有些引物PCR产物峰值普遍降低，将荧光标记引物与普通同一引物扩增经变性PAGE检测，结果表明PCR产物峰值普遍降低并非是引物扩增效率低引起的，而是引物末端标记的荧光衰退较严重，以至正常的PCR扩增产物只能检测到很低的峰值。

3.PCR条件的优化  本研究在PCR扩增过程中，部分样品未得到很好的扩增，现从以下几个方面分析其原因。

(1)模板DNA质量和浓度：DNA质量的好坏关系到PCR扩增效果。模板质量差时，如模板降解、模板中含有异物或模板核酸变性不彻底等会导致PCR扩增失败。加入模板的量与模板的纯度有关，纯度高的DNA模板比纯度低的加入量大，因为在DNA纯度较低的情况下，加入的DNA模板越多，PCR扩增体系中的杂质就越多，从而影响PCR扩增。模板的浓度不宜太高，否则易造成底物富集而不能扩增。本研究使用较早提取的DNA进行扩增时，扩增效果很差，甚至扩增失败，经琼脂糖检测发现DNA已大量降解。本研究发现DNA浓度太大时，扩增不成功。按常规方法提取的DNA加入50μl ddH2O溶解后经琼脂糖凝胶电泳检测，再稀释DNA浓度至约10ng/μl进行PCR扩增。

(2)退火温度和时间：进行大量PCR扩增前，要设置梯度筛选合适的退火温度或采用Touchdown PCR。退火温度(Tm)可根据引物中碱基的组成粗略推算。本研究中，由于所用引物是我们自己开发，所以摸索退火温度成为本研究的关键问题之一。为了快速摸索出条件并避免出现非特异性带，在保证其他条件不变的情况下，尽量选择较高的Tm值。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞，故可使引物和模板发生结合，大大减少非特异性结合的机会，复性时间一般为30～60s。本研究复性时间均为45s，使引物和模板完全结合，扩增效果好。

(3)引物浓度：在PCR扩增中，引物浓度过高，会降低反应的特异性，产生非特异性产物；引物浓度过低，会影响扩增量，出现弥散扩增。本研究所用的引物工作浓度为1pmol/L，10μl体系中加1μl。配好的高浓度引物贮备液事先分装保存，防止多次冻融导致引物变质降解失效。

(4)Mg2+浓度：在PCR扩增中，Mg2+浓度至关重要。一方面Taq DNA聚合酶是Mg2+依赖性酶，Mg2+浓度偏低会降低Taq DNA聚合酶活性，使反应产物减少；另一方面Taq DNA聚合酶活性对Mg2+浓度非常敏感，Mg2+浓度偏高，酶活性受到抑制。Mg2+的有效浓度受PCR扩增体系中的离子螯合剂和负离子基团的影响。当DNA中含有较高浓度的EDTA或dNTPs时都需加大反应体系中Mg2+的浓度。一般情况下，dNTPs的浓度为200μmoL/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmoL/L。本研究中，对Mg2+浓度设置梯度，间隔0.5mmoL/L，最终筛选出合适的Mg2+浓度。

(5)扩增片段长度：PCR扩增片段的大小直接影响着PCR扩增效率。同样的模板DNA，扩增小片段容易建立PCR扩增体系及条件，反之难度加大。本研究扩增小片段(100～300bp)时，易扩增且效果理想。

(6)循环次数：大多数情况下，20～30次是比较理想的循环参数。随着循环次数的增加，Taq DNA聚合酶活性降低，聚合时间延长，引物及单核苷酸减少等原因使反应后期容易发生错误掺入。所以在满足产物的前提下，应尽量减少循环次数。本研究中，在扩增中国地鼠微卫星位点时，适当增加了循环次数，为35次。

4.引物多态性检测  微卫星序列在群体中通常具有很高的多态性，微卫星的突变速率在不同物种以及同一物种的不同位点甚至在同一位点的不同等位基因间都存在很大的差异。在哺乳动物中，大多数的微卫星的突变率估计每世代10的-5次方～10的-2次方，人类家系的微卫星平均突变速率为10的-4次方；黑腹果蝇(drosophila melanogaster)受控雌性系中的突变率为每个位点10的-6次方左右。当微卫星被表达在缺乏有效错配修复系统的寄主中时，其不稳定性要比正常时高(5～10)×1000。Johnson和Pupko等认为，两条染色体间的DNA重组过程中发生的不等交换以及基因转换可能是引起微卫星多态性产生的主要原因。而Levinaon等认为在DNA复制合成过程中，发生了局部解链。有微卫星存在的区域新生链和模板链相对滑动，产生错配，使得一个或者几个重复单位形成环状未能参与配对，从而导致微卫星多态性的产生。本次微卫星克隆共对135个微卫星座位进行了引物设计和合成，通过对合成的引物进行最适退火温度筛选发现，一般核心序列重复数在十几个到几十个时所得微卫星最容易确定退火温度且多态性较高。但也不是重复数越多就越好。在草鱼基因组中微卫星分子标记的制备及筛选中发现HLJC17、HLJC19这两个微卫星引物，核心序列重复数分别为(CA)156、(CA)115，但在确定退火温度时却扩增不出带，分析原因可能是在本次微卫星克隆实验中，DNA片段要经过两次PCR扩增，最后得到的这种微卫星核心序列并不是草鱼基因组本身含有的，而是PCR扩增中由于新生链和模板链发生相对滑动而造成的假微卫星。

SQUIRRELL等(2003)在Eocolgy Molecular发表的文章对1997～2003年开发微卫星标记的情况进行了统计，在所有开发微卫星标记的研究中，平均只有24.1％的引物最终成为多态性的SSR标记，而1.77％的引物无多态性带，19.5％引物根本无法扩增。本研究中用成功的测序克隆设计引物进行扩增，筛选具有多态性的引物，为中国地鼠遗传图谱的构建以及近缘物种的遗传检测等开发微卫星引物。因此，设计得到的引物必须经过PCR在基因组DNA中进行扩增，剔除那些两个反应产物片段大小不一致、非期望片段大小的引物，引物才能成为可用的SSR标记引物。本实验目前仅开发少数的引物，在后续研究中还会开发更多的引物进行遗传图谱构建。

5.检测微卫星DNA的方法  检测微卫星DNA扩增结果的方法主要有4种：一是对高分辨率的琼脂糖凝胶电泳结果进行EB染色检测，这种方法比较方便，但检测的灵敏度和分辨率较低；二是采用放射性核素标记法，进行PAGE-放射自显影检测，这种方法的灵敏度和分辨率较高，但受辐射危害，而且操作比较费时、费力，不利于大量标记的快速检测；三是利用PAGE-银染方法进行检测，这种方法的灵敏度和分辨率较高，操作安全，是许多实验室采用的方法；四是利用毛细管电泳荧光标记检测，利用DNA测序仪确定扩增片段大小，在不同位点引物的Tm值相近及扩增片段大小有一定差异的情况下，还可同时利用多对引物多个位点进行检测，大大提高检测效率。由于SSR多态性片段长度可以小到2～4bp之差，这就需要更灵敏有效的检测方法。

变性PAGE银染检测法影响因素如：胶的均匀程度，如果玻璃板不平整，灌胶后的胶厚度会不均匀，导致电泳时条带出现弯曲，严重影响结果分析的准确性。电泳缓冲液随着使用次数的增加，阴、阳极的电泳缓冲液离子强度会发生变化，而且电泳时间的延长，DNA片段会出现弥散，银染的温度以及各步骤的时间等都会影响结果分析。变性PAGE银染法检测的不同样品DNA片段大小通过与已知分子量标准做比较得出来统计实验数据。由于不可能在每个泳道中点入分子量标准：所得片段大小只能用肉眼与分子量标准做比较估测得出，而且远离分子量标准泳道的数据准确性也会受到影响。在分析的材料和位点较多时，如何整合各胶板的数据以及保证数据的准确性是一个很难解决的问题。

毛细管电泳荧光标记检测法检测的各电泳样品中均含有分子量内标，各泳道的DNA片段大小直接与其泳道中的分子量内标相比就可精确获得。横坐标上给出了SSR片段的大小，纵坐标给出扩增DNA产物的相对数量，清晰明了。而且 GeneMarker软件能标出各引物的所有等位基因，只需统计待分析的样品的片段大小与那些等位基因的一致就可以了，数据的统计与分析更简化。

Pinar等(2003)利用毛细管电泳荧光标记检测法在50h内就完成了199份样品约1000个位点的分析，毛细管电泳荧光标记检测系统建立的高通量、高效率、高精确性的DNA自动化分析技术，尤其适用于大规模材料的分析研究。常规的变性 PAGE银染检测法由于无需昂贵的实验仪器，而且试剂成本也较为低廉，在分析少量的材料显得更经济适用。根据研究结果，我们认为在实验中将这两种方法有效地结合起来，利用常规的变性PAGE银染检测法筛选SSR标记，对入选的SSR标记采用荧光标记来完成。

本研究中先采用变性PAGE银染检测法进行摸索，由于引物和样本数比较多，因此改变了思路，采用毛细管电泳荧光标记法进行检测，证实毛细管电泳效率确实高，而且处理数据更方便快捷高效。本实验中用ABI3730毛细管电泳分析PCR扩增结果。毛细管电泳分析法是建立在聚丙烯酰胺凝胶电泳的基础上的，由于毛细管直径小、热量和电泳速度均匀、且不需载体等，因而比聚丙烯酰胺凝胶电泳的效果更好。所以微卫星位点的多态性利用毛细管电泳进行分析。

6.对引物序列质量的分析  最常见的位点检测报告是检测种群是否遵守哈迪.温伯格平衡。在哈迪-温伯格平衡中，种群不受自然选择的影响，种群内部个体之间随机交配，没有突变和迁移。如杂合子基因型频率的观察值高于期望值，就发生杂合子过度(又称纯合子不足)。相反，如果纯合子的观察值比预期值高的时候，就会发生纯合子过度(又称杂合子不足)。用genepop对样本数据进行哈迪-温伯格平衡检验，发现chm 115(P值等于0.000)、chm 14(P值等于0.000)、chm 140(P值等于0.000)、chm 9(P值为0.009)位点偏离了哈迪一温伯格平衡，且为杂合子不足，与用MStools计算出的H0/He比值以及micro-checker计算出的结果相吻合。杂合子不足的原因可能是因为样本个体间存在近交，也可能是取样太少，也可能这些位点正受到正向或负向选择。

另外，1928年Wahlund发现，如果一个群体被分为多个交配单位，纯合子的频率要高于哈迪一温伯格平衡比率。这种现象叫做Wahlund效应。Wahlund效应也可能是种群遗传学研究中杂合度不足的常见原因。

某个位点特定等位基因扩增失败也会导致杂合度不足，经micro-checker检验，本实验中也存在无效等位基因。无效等位基因是由于PCR条件不够理想或引物结合域发生变异而阻止了引物的结合，从而使一些等位基因在PCR反应中不能扩增。导致一些杂合子在确定基因型的时候就被确定为纯合子，还有一些个体根本无法扩增任何等位基因。通常情况下，导致产生无效等位基因的变异只在少数个体或种群中产生，所以杂合子不足不会在所有的种群中发生。对于验证引物来说，48个个体足以涵盖所有的等位基因(最多的等位基因为12个)。而且不符合哈迪一温伯格平衡不是舍弃一个位点的理由。