小鼠模型已经成为研究基因功能与致病机制、建立人相关疾病模型和评价研发药物安全性与有效性等生物医药研究不可取代的模式动物。转化医学研究就是针对来自临床患者实际问题，通过实验室包括分子、细胞及模式动物的相关基础及临床前研究，最终实现解决临床所面临的已知与未知的难题。所以，转化医学研究解决问题的思路与策略，就是将临床问题，通过实验室基础研究与临床前动物实验研究相结合，再将研究成果最终转化到临床实际应用的过程。 

如何应用小鼠模型发高质量文章？

应用小鼠模型开展临床前相关研究，是实现基础研究转化至临床应用的重要桥梁，而要想建立如此至关重要的连接桥梁，构建人源化小鼠模型是临床前研究必不可少的强有力工具。过去的研究实践告诉我们，要想发高质量水平的文章，理想的研究策略就是通过从临床实践中寻找与发现与疾病发生相关的潜在新基因，构建相应的基因编辑小鼠模型，以研究证实潜在疾病相关基因与人疾病的因果关系及其致病相关机制，从而为建立人相关疾病小鼠模型奠定基础，也为评价人相关疾病的临床治疗药物及方法的临床前研究创造了条件。 

在此，我通过分享我们客户今年发表于国际著名期刊《Circulation》上的高分文章《In Vivo AAV-CRISPR/Cas9-mediated Gene Editing Ameliorates Atherosclerosis in Familial Hypercholesterolemia》成功案例，进一步说明如何应用基因编辑小鼠模型，开展相关基因与疾病相互关系，以及如何通过该基因编辑小鼠模型，评估基因治疗疾病有效性等方面的研究思路策略与技术方法。 

1.家族性高胆固醇血症小鼠疾病模型的建立

文章作者首先从家族性高胆固醇血糖临床纯合子患者中（表现为血浆中高胆固醇和低密度脂蛋白升高，以及血动脉粥样硬化等表型），筛查到低密度脂蛋白受体（LDLR）未知新突变（比如E207X），且在体外细胞实验中证实，表达突变LDLR基因与其功能改变具有相关性。那么，如何证实该新发现的点突变与家族性高胆固醇血症与动脉粥样硬化的因果关系？作者明白，只依赖体外实验结果是很难具有真正说服力的，因此，作者计划在小鼠体内复制人LDLR-E207X点突变，以研究该基因新突变与疾病发生的关系。作者找到我们赛业生物寻求帮助，构建LDLR-E207X点突变小鼠模型。我们通过比对人LDLR与小鼠Ldlr基因序列，找到对应人LDLR E207X点突变位于小鼠Ldlr的E208X位置，应用CRISPR/Cas9基因编辑技术，设计相应的gRNA系列及供体DNA，通过显微原核注射方法，成功构建Ldlr-E208X点突变小鼠模型。研究结果表明，因为该点突变引入终止密码，导致小鼠Ldlr蛋白表达功能缺失，且该小鼠模型在高脂饮食诱导下出现明显高胆固醇血症及动脉粥样硬化表型。通过构建Ldlr-E208X点突变小鼠模型，作者不仅证实了Ldlr-E208X点突变与临床患者高胆固醇血症及动脉粥样硬化间的因果关系，而且也建立该疾病的小鼠模型。 

2.AAV-CRISPR/Cas9基因治疗

在此小鼠模型基础上，作者进一步探索基因修正疗法治疗该疾病的可能性与效果。应用肝特异性血清型AAV8载体介导的CRISPR/Cas9基因治疗技术，通过分别构建肝特异性表达AAV8-Cas9和AAV8-gRNA加正常Ldlr供体的表达载体，采用皮下注射方法治疗刚刚出生的Ldlr-E208X点突变小鼠，结果证实，经AAV8-CRISPR/Cas9基因治疗后，小鼠体内正常Ldlr蛋白表达出现一定程度恢复，且小鼠的高胆固醇血症及动脉粥样硬化表型也都获得一定程度的改善，表明AAV8-CRISPR/Cas9体内Ldlr修复治疗具有一定效果。作者通过从临床患者中发现可能的新致病基因，到构建点突变小鼠模型，证实该基因点突变与疾病的因果关系，再到证明AAV8-CRISPR/Cas9基因治疗，可以缓解疾病表型的验证，并最终提出了该疾病发生机制与治疗假说，即因LDLR E207X点突变，使该基因功能损伤，导致血中LDL含量增加，从而引起高胆固醇血症及动脉粥样硬化表型。而借助AAV8-CRISPR/Cas9表达载体修正肝脏LDLR基因功能，具有较低血中LDL作用，从而发挥缓解高胆固醇血症及动脉粥样硬化的治疗作用。 

该文章无论从研究思路与策略，再到技术方法，都为我们今后应用基因编辑小鼠模型，开展相关基因功能研究，疾病模型的建立，以及治疗方法及其效果评价提供了非常好的参考借鉴作用。 

为什么要构建人源化小鼠模型？人源化小鼠模型有哪几种类型？

过去人们提起人源化小鼠模型，首先想到是应用免疫缺陷小鼠，移植人细胞或组织，使小鼠体内含人免疫系统的人源化小鼠模型。然而，现在的人源化小鼠模型概念已扩展到包括，应用基因编辑技术，导入人相关基因，或者应用无菌小鼠，移植人肠道微生物等方法实现。所以，所谓人源化小鼠模型，就是指通过移植或基因编辑技术方法，将人细胞组织、人基因或人肠道微生物导入小鼠体内，构建的使小鼠体内含有人相关细胞或组织、基因或肠道微生物等类型的小鼠模型。 

为什么要构建人源化小鼠模型？由于人与小鼠作为不同物种，在遗传学、解剖学、生理病理及代谢等方面虽然有相似性，但也自然有许多不同，特别是其免疫系统存在明显差异，从而也限制了某些人致病病原体致病机制及抗感染/肿瘤微环境的相互作用等领域的研究，比如HIV病毒、登革热病毒、肝炎病毒、冠状病毒等感染人体病毒，小鼠却完全或非常不易感。通过将人源细胞移植至免疫缺陷小鼠体内，构建人源化免疫系统小鼠模型，使这类小鼠模型成为感染人病毒的易感模式动物，有助于建立人病毒病原体感染研究的小鼠模型。将肿瘤患者肿瘤组织移植免疫缺陷小鼠建立的PDX小鼠模型，也已成为当前临床肿瘤精准治疗的重要策略与技术方法，然而，如何真实反映与评价人源免疫细胞与肿瘤微环境在抗肿瘤免疫治疗中发挥的作用，则需要建立更加有效的人免疫反应体系小鼠模型。比如，CAR-T和免疫检测点抑制剂的抗肿瘤作用是离不开相关免疫细胞的参与，因此，构建含人源免疫细胞系统的人源化小鼠模型，在有效验证与评估抗肿瘤免疫治疗作用中发挥了至关重要的作用。 

近年来，抗CTLA-4和抗PD-1抗体作为免疫检测点（ICP）抑制剂临床抗肿瘤免疫治疗的成功，让人们看到了此类人源治疗性抗体研发的巨大发展前景。由于抗ICP人源抗体是针对人靶点，因此，如果计划应用小鼠模型，对抗ICP人源抗体的安全性与有效性进行临床前体内验证与评估，则需要借助基因编辑技术，比如CRISPR/Cas9或TurboKnockout（赛业生物建立的改良版ES打靶）技术，对小鼠相关抗体靶点基因进行人源化修饰，建立基因编辑的人源化ICP小鼠模型。目前我们也提供相关ICP人源化商品鼠，包括hCTLA-4、hPD-1、hGITR、hVISTA、hOX40、hCD28和hCD39等。 

另外，人体肠道微生物组已被认为是人体超级生物体的组成部分，是维持人体生态平衡重要器官之一。近来来，关于肠-脑轴和肠-肝轴概念的提出，已越来越说明，人肠道微生物组成不同及多样性，直接或间接影响到人体健康及疾病发生发展，以及药物治疗疾病作用。通过移植人肠道微生物组至无菌小鼠，构建人源化肠道微生物的小鼠模型，无疑有助于研究肠道微生物与疾病发生的因果关系、致病机制、药物治疗影响特殊微生物群等相关领域的发展。 

BRGSF新型免疫缺陷小鼠特征及其优势？

通过移植人细胞/组织至免疫缺陷小鼠方法，在小鼠体内重建人源免疫系统，被人们传统意义上，最早称之为人源化小鼠模型，而免疫缺陷小鼠则是该类人源化小鼠模型构建的基础。上世纪60年代初，免疫缺陷小鼠由早期的T细胞缺陷的裸鼠开始、经历了T细胞和B细胞缺陷的SCID小鼠，T细胞、B细胞和部分先天免疫细胞缺陷的NOD-SCID小鼠，发展到在NOD-SCID遗传背景基础上，通过敲除IL-2rg受体，分别构建了更为严重免疫缺陷（T/B/NK细胞缺陷）的NOG（2002年）和NSG （2005年）小鼠的重要里程碑阶段。另外，在BALB/c遗传背景小鼠基础上，通过敲除Rag2和IL-2rg受体，构建与NOG/NSG免疫缺陷相似的BRG小鼠（2005年）。

近年来，为了提高人源髓系细胞在小鼠体内的移植效率，人们又在NOG/NSG小鼠基础上，引入有利于人源髓系细胞发育成熟的人相关细胞因子，比如GM-CSF、IL-3和SCF等，分别构建了NOG-EXL和NSG-SGM3的改良型免疫缺陷小鼠。虽然，作为NOG/NSG构建基础的NOD-SCID小鼠，利用了NOD小鼠先天免疫部分缺陷与Sirpa基因变异特征，有利于人源细胞移植的优势，但NOD-SCID遗传背景小鼠也存在明显的先天不足，比如NOD背景小鼠中补体5基因功能损失，导致无法实现补体依赖性细胞毒杀伤作用（CDC）；而SCID背景小鼠又表现对放射性敏感性增加的特性，使其对某些基因毒性药物更加敏感，并容易发生自发性肿瘤形成的现象。另外，由于NOG-EXL和NSG-SGM3改良型免疫缺陷小鼠引入过表达的人相关细胞因子，使该类免疫缺陷小鼠移植人源细胞后，容易引起小鼠贫血现象，从而缩短了人源化小鼠模型的使用窗口期（一般也只有3～7个月时间）。 

BRG免疫缺陷小鼠是基于BALB/c遗传背景的小鼠，由于其Sirpa基因无法与人单核/巨噬细胞表面的CD47结合，形成“do-not-eat me”现象，因而不利于提高人源细胞移植效率。然而，由于BRG小鼠是直接通过敲除Rag2基因，实现小鼠T/B细胞功能缺陷，从而克服了SCID基因破坏引起的不足。而通过成功引入NOD-Sirpa至BRG遗传背景的小鼠上，建立的BRGS小鼠，克服了原先BRG 小鼠的不足，大大增加了其移植人源细胞的效率。且在BRGS小鼠基础上，敲除髓系细胞发育成熟相关的小鼠Flt3基因，成功构建的BRGSF新型免疫缺陷小鼠（2017年）更显示其独特的优势。 

与目前同类NOG-EXL和NSG-SGM2改良型免疫缺陷小鼠比较，在人源细胞（比如人CD34+造血干细胞）移植效率方面，特别是人髓系细胞（比如DC细胞），以及人源细胞在小鼠体内有效存活时间等方面，BRGSF新型免疫缺陷小鼠都表现有明显提高，再加上BRGSF小鼠无补体5及SCID基因的缺失，确保了该免疫缺陷小鼠作为有效评价CDC作用相关策略临床前研究的可能性。另外，因为没有采用转基因技术导入人相关细胞因子（如GM-CSF和IL-3等），也避免由此可能引起的移植小鼠出现贫血现象，使重建的人源免疫系统在BRGSF小鼠体内至少可以维持一年以上，大大提高了人源化小鼠模型的使用效率。 

BRGSF小鼠模型是抗体药物研发、疫苗开发、嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法的功效和安全性以及髓系发育研究的宝贵工具。此外，由于在BRGSF植入人造血细胞效率极高，因此它是制备免疫系统人源化（HIS）小鼠以研究和预测人类体内免疫反应的最佳模型。目前，我们赛业生物可为科研与医药研发等相关研究领域提供该种BRGSF免疫缺陷小鼠产品及相关技术服务。我们相信，BRGSF新型免疫缺陷小鼠的成功构建，将会极大促进人源化小鼠模型在转化医学研究中的应用。 

俞晓峰博士 赛业生物高级科学家

国际知名模式动物和细胞生物学专家。1995年于军事医学科学院博士毕业后，先后就任于耶鲁大学医学院、iTL基因打靶公司（作为资深科学家负责基因工程小鼠模型研发方案与策略设计）和纽约大学医学院。2010-2013年期间担任美国ASC生物技术公司研发部总监、服务部总监以及斯坦福生物技术公司副总裁等职务。目前任职于赛业生物科技，主要负责转基因鼠及基因敲除鼠平台的技术工作，其研究成果多次发表在Nature Immunology、Mol Cell Biol等高水平杂志上。