简介：COVID-19大流行在全世界造成了广泛的发病率和死亡率。导致人类SARS-CoV-2发病机制的临床特征包括炎症和血栓形成，但这些过程的机制细节仍有待确定。在这项研究中，我们展示了感染SARS-CoV-2的人类和恒河猴肺部的组织病理切片中的内皮破裂和血管血栓形成。为了确定与猕猴SARS-CoV-2发病机理相关的关键分子途径，我们进行了支气管肺泡灌洗和外周血的转录组分析以及血清的蛋白质组学分析。我们观察到肺部巨噬细胞浸润以及巨噬细胞，补体，血小板活化，血栓形成和促炎性标志物的上调，包括C反应蛋白，MX1，IL-6，IL-1，IL-8，TNFα和NF-κB。这些结果提示了炎症和血栓形成途径之间的关键相互作用导致了SARS-CoV-2诱导的血管疾病。我们的发现提示了COVID-19的潜在治疗靶点。

关键词：SARS-COV-2  血管  血栓形成  补体  血小板  巨噬细胞  IFNα 

简介：动物模型对于研究SARS-CoV-2的病理生理学以及疫苗和治疗的临床前评估是至关重要的。猕猴可能会感染SARS-CoV-2，并在上呼吸道和下呼吸道表现出强大的病毒复制能力。然而，尚未阐明SARS-CoV-2诱导的血管疾病的潜在途径。 人体研究表明炎症在COVID-19疾病的发病机理中起着重要作用，包括与疾病严重程度相关的促炎细胞因子升高。此外，对感染患者尸检标本和支气管肺泡灌洗液的研究表明，肺内补体激活和巨噬细胞可能与疾病严重程度有关。临床经验还证实，危重患者中存在高水平的D-二聚体（一种纤维蛋白降解产物），尸检样本中存在广泛的微血管血栓形成。这些特征在其他呼吸道病毒如流感病毒中并不常见。重度COVID-19患者的内皮细胞和血小板活化标志物也有所增加。在这项研究中，我们比较了人类尸检样本和感染SARS-CoV-2的恒河猴的肺部病理。 然后，我们使用整合的组织病理学，转录组学，蛋白质组学和细胞因子数据评估了恒河猴这些过程的潜在途径。

结果：人和恒河猴SARS-CoV-2感染与血管病变和血管内皮纤维蛋白沉积有关：SARS-CoV-2感染与微血管和大血管血栓形成以及严重的内皮损伤有关。我们观察到肺血管血栓、内皮炎和炎症，与最近发表的一项研究一致。

图1、人与恒河猴SARS-CoV-2相关血管病变的比较病理学研究。
COVID-19死者（A-D）尸检内皮组织病理学图像显示。（A） 隔膜毛细血管血栓（箭头；H&E染色）。（B） 肺泡内血栓（箭头）和肺泡间隔内纤维蛋白沉积（洋红色）（Carstairs染色）。（C） 肺泡因淋巴细胞浸润而扩张，组织肺炎（箭头）和中等大小的小动脉内皮损伤（箭头），淋巴细胞位于血管壁内膜和中膜内，并扩张相邻的肺泡间隔（Verhoeff-Van Gieson[vvG]染色）。（D） 组织性肺炎伴Ⅱ型肺细胞增生（箭头），血栓形成（＊）伴间隔血管内皮炎，淋巴细胞破坏内皮（箭头；H&E染色）。（E） 感染SARS-CoV-2的恒河猴的组织病理学图像显示内皮细胞增生（H&E染色）。（F） 局灶性内皮增生（vvG染色）。（G） CD3（白色）、CD31内皮细胞（绿色）、α-平滑肌肌动蛋白（aSMA，红色）和DNA（蓝色）的血管周围淋巴细胞募集和外渗。（H） 高倍镜显示CD8+T淋巴细胞沿内皮细胞边缘。（I） 肺泡间隔毛细血管微血栓（H&E染色）。（J）血管增生和闭塞（vvG染色）。（K）肺泡隔中的纤维蛋白沉积（品红色）（Carstairs染色）。（L）纤维蛋白沿血管内皮沉积（Carstairs染色）。（M）von Willebrand因子（vWF）。（N）攻击后2（D2）和4（D4）天，未感染和SARS-CoV-2感染的猕猴的1型胶原蛋白的免疫组织化学。接下来，在感染SARS-CoV-2后的第2天和第4天对成年恒河猴（6-12岁）的肺组织切片进行了评估。组织病理学显示包括内皮炎在内的显着血管变化，与人类报道的相似，其特征在于增生性内皮，内膜增生以及巨噬细胞和淋巴细胞对内皮和血管周间隙的粘附。用Van-Verhoeff-Gieson弹性纤维银染法观察炎性中型动脉内膜增厚。使用组织多重免疫荧光（t-CyCIF），我们观察到大量CD8 + T淋巴细胞粘附于内皮细胞以及与内皮炎相关的血管周区域。还观察到肺泡间隔有微血栓（图1I），与人类相似。感染猕猴内皮细胞内膜不规则增厚也与血管管腔狭窄有关。在肺泡隔和沿血管内皮观察到早期纤维蛋白沉积。在感染SARS-CoV-2的猕猴上观察到的这种血管病变，在猴免疫缺陷病毒（SIV）或寨卡病毒（ZIKV）感染的恒河猴身上没有观察到。我们还观察到肺实质，包括血管周围和肺泡间隔内广泛的I型胶原沉积，这与人类纤维增生和肺纤维化的报道一致。与未感染的对照组相比，整个感染动物肺部的vWF都增加了，包括沿血管内皮细胞的腔侧和肺泡间隔内。

图S1、感染SARS-CoV-2、ZIKV或SIV的猕猴的内皮细胞变化比较，如图1所示。

SARS-CoV-2感染可快速诱导血栓形成激活因子的分子特征：为了确定SARS-CoV-2感染激活的关键生物学过程和途径，我们在第1、2、4、7、10和14天对BAL和外周血样本以及血清蛋白质组学进行了RNA-seq转录组学分析。来自BAL和外周血的数据显示，在第1-4天表达升高的基因在第14天已基本恢复正常，包括干扰素和SARS-CoV-2转录本。

图S2、SARS-CoV-2诱导感染猕猴在激发后1-14天的BAL和外周血中的转录变化。（A） 条形图显示SARS-CoV-2感染后第1-14天BAL（左）和外周血（右）中差异表达基因（DEGs）的数量。（B） 基线（激发前）和激发后第1、2、4、7、10和14天SARS-CoV-2病毒基因和干扰素α基因的标准化读取计数热图。使用血栓形成相关途径的精选列表，对BAL和外周血中表达的基因以及血清中检测到的蛋白质进行了基因集富集分析（GSEA）。该列表包括与中性粒细胞和单核细胞介导的炎症反应，血小板活化和聚集相关的转录因子的信号传导，以及凝血，血小板生成素信号传导，血小板活化和颗粒化，蛋白质粘附，纤维蛋白凝块形成和凝血级联反应的特征。

图2、感染SARS-CoV-2的恒河猴BAL、外周血和血清中血栓形成、凝血和纤维蛋白沉积的分子特征。

GSEA显示感染的猕猴的BAL、外周血和血清中与凝血、血栓形成和血管疾病相关的转录组和蛋白质组学特征显著丰富。在BAL，外周血和感染猕猴的血清中，凝血和凝血级联的途径在第1-14天增加，包括凝血和组织因子，凝血级联的标志物以及与细胞外基质降解有关的金属蛋白酶基因。血栓调节蛋白（THBD）是与凝血酶结合的内皮特异性I型膜受体，F13A1编码凝血因子XIIIA。此外，胶原蛋白是通过各种机制（包括与vWF结合）响应组织损伤的血小板活化和聚集的主要介质之一。我们观察到BAL、外周血和血清中胶原和蛋白质粘附标记物显著增加，而vWF仅在激发的猕猴的外周血和血清中上调。这些转录组学和蛋白质组学结果证实了我们的组织病理学和免疫组化（IHC）数据。BAL，外周血和被感染猕猴的血清中上调了先前在严重炎性疾病患者中报告的其他与血栓形成相关的标志物，凝血因子和HIF1α信号通路。此外，感染猕猴的BAL、外周血和血清中血小板活化、聚集以及细胞外基质组织（COL1A1、COL1A2、FN1、PF4、IGF1和ADAM15）的标记物也增加。

图S3、 猕猴感染SARS-CoV-2可增加人类观察到的严重炎症性疾病标志物和严重COVID-19疾病标志物的表达。

SARS-CoV-2感染在猕猴中诱导干扰素和炎性途径以及促炎细胞因子：差异基因表达分析显示，早在第1天，BAL和外周血中的病毒感测和干扰素刺激基因（ISG）和促炎标记物就显著增加，类似于先前感染SARS-CoV-2的人的报告。GSEA显示感染猕猴BAL和外周血中IFNα（IFNα）、IFNγ（IFNγ）、TNFα和炎症信号通路在第1-4天显著增加。我们观察到在BAL和外周血中ISGs和抗病毒基因（包括MX1、MX2、IFIT1-3、ISG15、IRF7、IFTM1、IFTM2、OAS1/2/3、DDX58和IDO1）的显著上调，以及炎症小体途径、Toll样受体（TLR2/5/7）、TNFα、集落刺激因子（CSF）和NF-κB的上调。此外，我们还比较了感染猕猴BAL中IFNα基因和ISGs以及炎症标志物MX1、IRF7、TNF、NLRP3和NF-κB的表达水平，发现ISGs和其他炎症标志物的表达量高于IFNα基因。此外，感染SARS-CoV-2的猕猴BAL、外周血和血清中ISGs和炎症标志物也增加。

图3、SARS-CoV-2对感染猕猴BAL和外周血中干扰素和炎症途径的影响

图S4、 SARS-CoV-2在猕猴中增加了严重至重度COVID-19干扰素和炎性信号的表达。

血清中C反应蛋白（CRP），IFNA7，ISG15，MX1和IDO1等的血清蛋白水平验证了SARS-CoV-2在猕猴中炎症和ISGs标记的上调。使用免疫组织化学，我们进一步验证了MX1的上调，MX1是干扰素诱导的蛋白，对多种RNA病毒和磷酸化STAT3（pSTAT3）具有抗病毒活性，并被多种细胞因子和生长因子（包括IL-6）激活。转录组分析显示BAL和外周血细胞因子及其下游信号通路显著增加，包括IL-1RN、IL-6、IL-8、IL-4、IL-10、IL-27、IL-18、IL-15、IL-12和IL-17。

图4、SARS-CoV-2对感染猕猴BAL、外周血和血清中细胞因子和趋化因子的上调或下调。

在感染猕猴的血清中，我们观察到促炎细胞因子和趋化因子如CXCL11、IL-1RN、CXCL10、IL1-RL1、CCL8、CCL2和CXCL12的蛋白水平以及IL-8、IL-6和GM-CSF的下游信号也在感染动物的血清中升高。

图S5、感染SARS-CoV-2的猕猴血清、BAL和外周血中细胞因子信号、先天性和适应性免疫细胞群以及免疫衰竭的特征增加

图S6、感染SARS-CoV-2的猕猴的BAL和外周血中细胞死亡，凋亡和代谢的分子特征增加。

我们还观察到在激发后1-4天，BAL和外周血中M0、M1和M2巨噬细胞以及IL-6-、IL-10-和IFNα激活的巨噬细胞的转录富集。与t-CyCIF分析一致，SARS-CoV-2可显著增加猕猴BAL和外周血巨噬细胞标志物（CD163、CD68）。

血小板活化与SARS-CoV感染：与未感染的对照组相比，SARS-CoV-2感染后第2天和第4天，恒河猴的肺脏切片显示补体途径关键成分的表达增加，包括补体受体1（CR1）和C3。对感染的猕猴的BAL和外周血进行的转录组学分析类似地显示了BAL和外周血中1-4天补体途径的上调，包括补体标记物C1R，C1S，C1QA和C1QC、 ficolin标记; 组织因子F3；纤维连接蛋白FN1。我们进一步通过蛋白质组学验证了血清中补体级联的上调，，这表明血清中多种补体成分和补体级联水平增加，包括C1R、C1QC、C3b/C4b受体1（CR1）、C3和凝血因子II、V、IX和X（F2、F5、F9和F10）。

图5、多重cycf免疫荧光图像显示SARS-CoV-2激发猕猴肺部的巨噬细胞以及感染猕猴BAL、外周血和血清中的巨噬细胞转录特征

图6、SARS-CoV-2增加了感染猕猴BAL、外周血和血清中补体激活和凝血级联途径。

图S7、SARS-CoV-2感染增加了被感染猕猴BAL和外周血补体信号、血小板活化和粘附以及巨核细胞的表达。

最后，我们的分析显示，SARS-CoV-2增加的固有免疫标记物的表达水平与BAL的病毒载量呈正相关，包括细胞因子和炎症标志物（IL-6R、IL1RN、IL-10、CXCL10、TNF、NFKB1和NLRP3）、ISG（IRF7、IFT1和MX1）、IFNα基因（IFNA2、IFNAR2和IFNA4）和血栓形成相关标志物(C1QA, C3AR1, THBD, 和FN1).。这些标记物也与激发后1-10天BAL的病毒载量呈正相关。值得注意的是，这些标记物的表达在第10-14天恢复到正常水平，与猕猴从感染中恢复相一致。

图7、感染猕猴BAL中与SARS-CoV-2病毒载量相关的促炎细胞因子，ISG，IFNα和补体级联基因

总的来说，我们的数据表明IFNα、促炎性细胞因子、活化的巨噬细胞和补体激活在触发SARS-CoV-2感染的内皮损伤和血栓形成中起着关键作用。这些发现提高了我们对恒河猴SARS-CoV-2发病机制的理解，并提示炎症和血栓形成途径之间的相互作用是SARS-CoV-2相关血管疾病的原因之一。这些数据还提示了干扰素、炎症、凝血和补体途径的治疗靶点。

原文出自：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867420313118