利用GenBank数据库，用生物信息学方法比较中国地鼠与人类、小鼠、大鼠、田鼠的线粒体全基因组序列，分析其序列差异，构建分子系统关系，对使用中国地鼠复制新的疾病模型、研究发病机制、治疗方法等具有重要价值。线粒体上的基因序列，尤其是其中的蛋白编码基因通常被用来研究动物物种进化，取得了很好的结果。线粒体基因组全序列包含了更多的信息，比单个基因或者是部分线粒体序列通常能得到更加可信的结果。因此本文通过中国地鼠的线粒体基因组全序列来研究与其他鼠科动物的系统发生关系和分歧时间。

实验技术路线见图8-1。

一、实验材料

1.实验动物  实验动物是山西医科大学实验动物中心饲养的中国地鼠。

2.主要试剂和材料来源

(1)三氯甲烷，无水乙醇，异戊醇，氢氧化钠，NaCl，Tris饱和苯酚(分析纯，北京化工厂)。

(2)蛋白酶K(德国MERCH，20mg/ml或粉剂)。

(3)所有引物由北京擎科生物技术公司合成。

(4)琼脂糖(西班牙BIOWEST公司)。

(5)Tax DNA聚合酶(大连宝生物公司，ET101)。

(6)DNA分子量标准(天为时代公司，DMarker 2000)。

(7)DNA纯化试剂盒(大连宝生物公司)。

(8)Tris饱和酚(北京鼎国生物试剂有限公司)。

3.主要试剂的配制  药品及试剂的配制主要参考卢圣栋编写的《现代分子生物学实验技术》(第2版)。

A.提取DNA所用的相关试剂

(1)1mmol/L Tris-HCl：12.1g Tris碱，用水60ml，浓盐酸调至pH＝8.0，混匀

后补水到100ml，高压灭菌，4℃储存。

(2)0.5mol/L EDTA(pH8.0)：在700ml水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二钠EDTA-Na2·H2O，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用10mol/L NaOH调pH至8.0(约需50ml)，然后定容至1L，分装后高压灭菌备用。

(3)TE：10mmol/L Tris-HCl(pH＝8.0)，1mmol/L EDTA，高压灭菌，4℃储存。

(4)5mol/L NaCl：NaCl 29.2g，加去离子水70ml，溶解后定容至100ml，高压

灭菌，4℃储存备用。

(5)25％十二烷基硫酸钠(SDS)：称取SDS(电泳级纯)250g，加水750ml；用

加热至68％的助溶浓HCl调pH至7.2，加水定容至1000ml，分装备用。

(6)蛋白酶K(10mg/ml)：1g蛋白酶K，加无菌去离子水100g，充分溶解，－20℃储存。

(7)STE(组织DNA抽提液)配方：见表8-1。

B.琼脂糖电泳所用的有关试剂

(1)10×TBE：Tris 108g，硼酸56g，EDTA 8g，加水至1L，充分混匀。

(2)1.0％琼脂糖凝胶：0.8g琼脂糖，加1×TBE 80ml，加热充分溶解，冷却至约50℃，加GoldViewTM少许(1mg/ml)，摇匀，倒入准备好的胶槽中，凝固后使用。

(3)核酸电泳上样缓冲液(6×)：溴酚蓝0.25％和蔗糖水溶液40％(W/V)，用水配置，4℃保存。

4.分析工具软件及功能网站

同源分析软件：DNAMAN及BLAST(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)

DNA序列分析软件：Chromas

引物设计软件：primer5.0，Oligo6.0

引物分析：http：//www.idtdna.com/

二、实验方法

1.基因组DNA的提取

(1)剪中国地鼠肝脏组织，放到盛有1ml无水乙醇的离心管中，－20℃保存备

用。

(2)每份样品取1mg于1.5ml离心管中，用剪子将样品尽量剪碎。

(3)向各个离心管中加入600μl的STE(组织DNA抽提液)，并加入1.2μl Rnase(10mg/ml)，充分混匀，37℃水浴2h。

(4)向各离心管中加入10μl蛋白酶K(20mg/ml)，再加入15μl 20％SDS充分混匀，55℃水浴消化过夜。

(5)各离心管中加入等体积酚(约600μl)，轻摇混匀10min，12000r/min，4℃离心10min。

(6)取上清，加等体积酚(约600μl)，摇动混匀10min，12000r/min，4℃离心10min。

(7)取上清，加入等体积酚：三氯甲烷：异戊醇(25：24：1)，轻摇10min，12000r/min，4℃离心10min。

(8)取上清，加入等体积的三氯甲烷：异戊醇(24：1)600μl，混匀10min，12000r/min，4℃离心10min。

(9)取上清，加入1/10体积的NaAc(约60μl)及2倍体积的冰乙醇(约1ml)。

(10)盖紧管盖，水平摇晃数次即可见到絮状DNA沉淀。

(11)将样品置于冰上15～30min，取出，12000r/min，4℃离心10min，使DNA沉淀于离心管底部。

(12)弃上清，加入75％乙醇至离心管2/3体积。混匀漂洗以除残余的盐，12000r/min，4℃离心2min。

(13)小心倒掉乙醇，将离心管倒扣于吸水纸上，室温干燥。

(14)待乙醇完全挥发尽，加入150～200μl ddH2O，4℃过夜以溶解DNA。

2.DNA浓度和纯度的检测  琼脂糖凝胶电泳：取3μl ddH2O溶解的DNA和1μl加样缓冲液混匀，上样于1.0％琼脂糖凝胶，同时上样DNA marker，180V电压电泳10min左右，紫外灯下观察电泳结果。与DNA marker比较电泳条带的亮度、整齐度及位置，估计其浓度、纯度及片段大小，然后拍照。

3.引物设计  参照KK小鼠(登录号为EF108339)、Wistar+大鼠(登录号为AC000022)、豚鼠cavia porcellus(登录号为AJ222767)、台湾田鼠(登录号为NC003041)、南方田鼠(登录号为NC008064)等动物的线粒体基因组全序列，采用CLUSTAL×1.8软件进行序列比对排列后，用Oligo6.0软件设计可覆盖中国地鼠线粒体全基因组的引物27对(表8-2)(北京擎科生物技术有限公司合成)。

4.PCR扩增及产物鉴定    PCR反应体系为25μl：

基因组DNA(约10ng)    1.0μl

10×buffer            2.5μl

Mg2+(2.5mmoL/L)       2.0μl

dNTPs(2.5mmol/L)      2.0μl

primer-F              1.0μl

primer-R              1.0μl

Taq酶(TaKaRa)         0.25μl

ddH2O                 15.25μl

PCR采用降落式PCR(touchdown PCR)扩增程序，循环参数如下：

94℃预变性5min

（94℃变性30s、48℃退火1min、72℃延伸1.5min）2次循环；

（94℃变性30s、47℃退火1min、72℃延伸1.5min）2次循环；

（94℃变性30s、46℃退火1min、72℃延伸1.5min）2次循环；

（94℃变性30s、45℃退火1min、72℃延伸1.5min）2次循环；

（94℃变性30s、44℃退火1min、72℃延伸1.5min）30次循环；

72℃延伸10min。

取3μl PCR产物和2μl DNA Marker 2000(北京天为时代公司)，进行1.0％琼脂糖凝胶(1×TBE)5V/cm电泳。以2μl DM2000中对应条带的强度(50ng)作为参照，对PCR产物进行粗略定量分析。用紫外观察PCR产物扩增情况，凝胶成像仪扫描记录结果。

5.产物纯化、测序和序列拼接

(1)产物纯化：用SAP酶纯化PCR产物，取6μl PCR产物加入2μl SAP酶溶液，于37℃ PCR仪45min，85℃ 15min灭活。选用SAP-ExonⅠ纯化法，主要利用 ExonⅠ可降解原PCR反应中残留的单链PCR产物，SAP去除原PCR反应中残存的脱氧核苷三磷酸基团，从而达到纯化的目的。

(2)测序：纯化后用ABI 3730 DNA序列自动分析仪进行双向测序(中国科学院北京基因组研究所)。最后，用DNA序列分析软件分析胶图文件和原始的数据信号，得到最终的测序结果。

(3)序列拼接：利用DNASTAR和测序峰图结果分析软件Chromas 2.22对测序结果进行序列拼接，拼接后留下的少许空隙重新设计用来补洞的引物，最后得到中国地鼠线粒体全基因组全序列。

6.序列分析  所获得序列使用BLAST在线查询服务(http：//www.nebi.nlm.nih.gov/blast/)在核酸数据库(nr database)和线粒体DNA数据库(mito database)中进行同源序列查找。

Clustal W 1.8对序列进行对准(alignment)，以及序列间相似率的统计。使用DNASTAR软件包的Editseq程序对序列进行开放阅读框的查找，蛋白编码序列的翻译，氨基酸编码情况的调查，序列互补链的获得，序列核苷酸组成的统计。

使用RNAStructure 4.5软件，利用能量最小原理对mtDNA的rRNA稳定的二级结构进行预测。DNASTAR统计序列总长、碱基百分比、GC含量等信息，并与金黄地鼠及其他哺乳动物线粒体全基因组信息进行比较。

使用DNASTAR中Mapdraw预测中国地鼠线粒体全基因组序列的11种主要的限制性酶的酶切图谱，这11种限制性内切酶为ApaI、AvaI、BanII、BglI、EcoRI、HindIII、KpnI、SacI、BamHI、BglII、EcoRV。

通过与小鼠线粒体基因组比较和软件分析(DNASTAR、RNAStructure4.5、tRNAScan-SE1.21)定位tRNA基因、蛋白编码基因、rRNA基因和D-loop区。

三、结果

1.PCR扩增结果  利用上述27对引物和反应条件进行扩增，得到的27个 PCR产物经纯化后电泳，结果如图8-2(因为是用纯化后产物电泳，所以图中没有空白对照)，可见PCR产物的分子量大小与引物设计的一致，且没有杂带，条带特异，说明PCR产物可信，可以用来测序。

2.中国地鼠的线粒体基因组总长和碱基组成  测序后序列拼接得到中国地鼠的线粒体基因组序列全长为16283bp，利用DNASTAR统计中国地鼠线粒体全基因组的L链，碱基含量为A 5492个、C 3712个、G 2113个、T 4966个，A含量占33.53％，G含量占12.98％，T含量占30.50％，C含量占22.80％，A％＞T％＞C％＞G％，(A+ T)％(64.23％)＞(C+G)％(35.77％)，这特别高的A+T含量在其他哺乳动物中也有发现，且蛋白编码基因的第三个密码子呈AT偏好(文中未列出)。与仓鼠属另一物种金黄地鼠及其他哺乳动物线粒体基因组比较(表8-3)可以看出，这两种地鼠的线粒体基因组总长、碱基组成非常相近，同源性达84％，与其他哺乳动物线粒体基因组相比长度略短，但同源性也较高，除了金黄地鼠外，中国地鼠与小鼠、大鼠、田鼠同源性分别为80％、81％和80％，这与它们同属于啮齿目鼠科动物一致。中国地鼠的线粒体基因组序列已提交GenBank，序列号为EU660217。

3.中国地鼠的密码子使用情况  中国地鼠的密码子使用情况见表8-4。从表8-4可见。中国地鼠线粒体基因组全序列中，密码子CTA使用频率最高达136次，其次是CAA 125次、CAG 116次、GAG 73次、CAC 73次等。同义密码子的使用表现出强烈的偏倚性，使用极不平衡，如编码亮氨酸(L)的3种同义密码子中，CTA使用频率最高，达136次，其次是CTC 69次、CTG 46次。如果无自然选择或突变偏倚，则可期望基因编码同一氨基酸的各个同义密码子以相同的频率出现。但实际上，编码同一氨基酸的各个同义密码子通常有不同的频率，密码子使用存在很大偏倚，常用相对密码子使用频率来对密码子使用偏倚进行测度。但中国地鼠线粒体编码其他各种氨基酸的密码子使用情况与以上分析相似，表明线粒体基因密码子使用存在明显偏倚性。

4.中国地鼠线粒体基因定位

(1)中国地鼠线粒体基因组tRNA定位分析：通过序列比对和软件分析，找到中国地鼠线粒体基因组的22个tRNA(表8-5)(有两个tRNA-ser和两个tRNA-leu)，用来运载18种氨基酸，它们的碱基长度在59～75之间。我们用RNA Struc ture 4.5软件预测了它们的二级结构(图8-3)。

(2)中国地鼠线粒体13个蛋白编码基因的定位分析结果：哺乳动物线粒体密码子不同于核基因组，通过分析定位了13种蛋白编码基因(表8-6)，其中包括7个 NADH脱氢酶亚基(NADH dehydrogenase subunit)、3个细胞色素氧化酶亚基(cytochrome oxidase subunit)、2个ATP合成酶亚基(ATP synthase F0 subunit)、1个细胞色素b编码基因(cytochrome b)。这些蛋白编码基因没有内含子，有些与其他基因重叠少许碱基，这些基因总长11398bp，占全长的69.0％。NADH脱氢酶亚基6(ND6)定位在重链上。这13个蛋白编码基因除ND1以GTG、ND2以ATT、ND3以ATA和ND5以ATT为起始密码子外，其他的均以ATG为起始密码子，它们大多以TAA为终止密码子，ND1、ND3、ND4、COX3以单个碱基终止。

(3)中国地鼠线粒体2个rRNA的定位分析结果：哺乳动物线粒体的rRNA具有高度的保守性，它们的位置固定，12S rRNA位于tRNA-Phe和tRNA-Val之间，16S rRNA位于tRNA-Val和tRNA-leu(UUA)之间(Anderson S, et al. 1981)。12S rRNA起始位置为71，终止位置为1023，长度953bp；16S rRNA起始位置为1096、终止位置为2656，长度1561bp。有报道认为12S rRNA和16S rRNA在哺乳动物线粒体中很保守(Hurst C D, 1999)，我们比对了中国地鼠和金黄地鼠的rRNA基因和蛋白编码基因，12S rRNA和16S rRNA的同源性分别为91.0％和87.3％，高于所有蛋白编码基因间的同源性。

(4)中国地鼠线粒体1个D-loop区的定位分析结果：中国地鼠线粒体基因组的D-loop区在15417～16283之间，长度867bp，与金黄地鼠的D-loop区长度(867bp)相同。

5.中国地鼠线粒体基因组结构(图8-4)  阅读框除ND6外均在H链上，中国地鼠虽然是染色体数目少、染色体大的哺乳动物，但与GenBank上登录的73种哺乳动物线粒体全基因组相比，它的线粒体基因组结构还是和其他哺乳动物十分相似。

6.中国地鼠线粒体基因组酶切图谱分析  利用DNAstar-MapDraw构建了中国地鼠线粒体基因组限制性内切酶酶切图谱，选择了只有1～2次切点的42种酶切，共有62个酶切位点(图8-5A)。选择了ApaI、AvaI、BanII、BglI、EcoRI、HindIII、KpnI、SacI、BamHI、BglII、EcoRV 11种内切酶，发现有29个酶切位点，每种酶切的片段大小不同，酶切位点也不同，而且其中BamH、BglII、EcoRV3种酶没有酶切位点(图8-5B和表8-7)。

三、讨论

1.线粒体全基因组测序方法  目前国内外线粒体全基因组测序一般采用以下4种方法：①酶切或超声打断线粒体DNA，建cDNA文库，鸟枪法测序拼接；②酶切建亚库，载体测序拼接；③参照近源物种的线粒体基因组设计能覆盖全基因组的引物，PCR扩增测序拼接；④Long-PCR，步移法测序拼接，我们采用第三种方法。 Genbank有几种啮齿类动物的线粒体全基因组序列，我们采用同源序列比较的方法，找到相对保守的区域进行引物设计，这样引物具有一定的特异性。而且第三种方法不需要纯的线粒体DNA，不需酶切和建库，也避开了Long-PCR，所以相对来说实验简单容易控制、周期较短。

2.中国地鼠线粒体全基因组的特征  中国地鼠线粒体基因组全序列为16283bp，有22个tRNA、13个蛋白编码基因、2个srRNA和D-loop区，和其他哺乳动物相比结构基本类似。我们找到了中国地鼠线粒体基因组的22个tRNA(表8-5)，还利用计算机模拟显示这22个tRNA的二级结构图，发现tRNA-ser(AGC)为二叶草结构，缺少“DHU”臂，而tRNA-ser(UCA)是标准三叶草结构(图8-3)，其他此前报道的物种(人和牛等)的tRNA二级结梅预测中也发现了类似现象，并有实验证实存在这种特殊的二叶草结构。

中国地鼠线粒体基因组的排列顺序与多数脊椎动物相似，且与已知的啮齿类动物的线粒体基因组基因排列顺序完全相同，表明啮齿类线粒体基因组在进化上具有高度的保守性。中国地鼠mtDNA的tRNA含一个典型的“stem-loop”结构，这个区域被认为是L链的复制起点(OL)，在很多脊椎动物，如石龙子、蛇类、鱼类、两栖类、哺乳类等都有类似结构，但在楔齿蜥、鸟类。鳄类中尚未发现。由此看来，这个结构特征可能具有种属特异性，推测它在脊椎动物线粒体基因组中是一个比较进化的特征。

3.关于降落PCR的方法  PCR过程中采用了降落式PCR，容易扩增出目的片段，而且可以批量进行PCR，减少PCR次数。在进行PCR扩增时，受到许多参数的影响，这些参数包括循环次数、Mg2+、dNTP、引物和模板，通过改变这些条件来使产物获得最佳效果。其中退火温度是影响PCR特异性的重要因素，变性后温度快速冷却至40～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞机会远远高于模板互补链之间的碰撞。在Tm值允许的范围内，选择较高的温度可大大减少引物和模板之间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。

降落(touchdown, TD)PCR技术的基本原理为：根据引物的Tm值，设置一系列从高到低的退火温度，开始选择的退火温度高于估计的Tm值，随着循环的进行，退火温度逐渐降低至Tm值，并最终低于Tm值。在每一个停留的退火温度上循环2次。当达到引物与模板结合的Tm值时，扩增开始，当降低到非特异性扩增发生的水平时，特异产物会有一个几何级的起始优势，在剩余反应中，特异产物具有绝对竞争优势，提高其特异性。降落PCR代表了一种不同的优化策略，通过在一个程序中采取一系列不同的退火温度进行扩增循环。如果观察到许多产物带，可提高 TD-PCR的最高退火温度和最低退火温度，使其范围上移，减少最低退火温度条件下的循环次数，使各退火温度下的循环数增加1个，同时减少较低退火温度或恒定退火温度循环的次数。如果未检测到产物或产物带很弱，可将反应产物在恒定退火温度下再反应10个循环并重新分析。

本实验主要采用常规PCR及降落PCR两种方法进行扩增，并比较了两种方法的扩增策略和效果，期望找到一种尽可能地提高扩增效率和产物产量的扩增策略。在本研究进行的初期，试图利用常规PCR对同一反应体系进行扩增，但尽管不断改变退火温度(48、46和44℃)，普通PCR均仅扩增出1对引物的目的片段。应用 TD-PCR法对此反应体系进行扩增时，没有进行最佳退火温度的摸索，直接简单地设计了PCR扩增程序，即顺利扩增出目的片段，而且特异性，条带和目的片段大小一致。表明在对中国地鼠线粒体基因进行扩增时，TD-PCR法显著优于常规PCR法。本实验中4对引物的Tm值分别为48、44、45和47℃，比较接近，因此可在同一循环条件下进行，大大提高了工作效率。总之，降落PCR是一种潜在的一步法找到最佳退火温度的方法。

普通PCR和TD-PCR相比，普通PCR程序简单、省时，一般的PCR仪都可完成，但缺点是退火温度不适当时容易出现假阴性；而TD-PCR虽然程序复杂，需要 PCR仪有较大的内存，但能非常有效地降低或避免假阴性，且不在理想的工作条件(比如最佳Mg2+浓度)下增加特异性和目的产物的产量。