我们之前分享了诺奖级CRISPR技术在基因编辑动物中的应用，其中基因敲除小鼠是我们研究基因功能必不可少的利器，主要分为全身性基因敲除和条件性基因敲除。然而，全身性基因敲除的小鼠存在着无法忽视的缺陷，例如：不能特异性地研究特定基因在特定组织内（及特定的时间）的功能；全身性基因敲除小鼠有时因某些基因对胚胎发育的影响而无法正常分娩；或因出生后严重的生理缺陷而过早死亡；或不能产生后代而不能获得纯合子动物模型。因此，条件性基因敲除小鼠虽然有周期长、费用高、需要配合特定工具鼠使用等劣势，但仍获得了越来越多的选择与喜爱。

今天，就和大家一起来了解下条件性基因敲除方法必用的Cre-loxP重组系统以及应用Cre-loxP进行条件性基因敲除的原则。

概述

Cre-loxP重组系统，即对一段特定的DNA序列进行定位并用Cre重组酶对其进行剪接，由Cre重组酶和loxP位点两部分组成。

其中Cre蛋白，最初由“导致重组（Cause recombination）”命名，也有文献命名为“环化重组酶（Cyclizationrecombinase）”。Cre重组酶（CyclizationRecombination Enzyme）由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，是由343个氨基酸组成的38kD的蛋白质。它不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能够特异性识别loxP位点, 从而重组或删除loxP片段间的基因。

loxP（Locus Of X-over P1）是P1噬菌体基因组中34bp的特殊位点序列，包括两个13bp的反向重复序列和一个8bp的间隔区域。其中，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了loxP位点的方向，间隔区中的“N”代表这个碱基是可变的：

发展历史

1985年，R H Hoess, K AbremskiCre-Lox首次发表了大肠杆菌噬菌体P1的Cre-lox位点特异性重组系统的断裂和交换机制文章。

1987年，Brian Sauer博士把大肠杆菌噬菌体P1的Cre-lox位点特异性重组系统在酿酒酵母中即真核系统中进行了功能表达，提出了Cre介导的位点特异性重组可能是调节真核生物基因组重排的有用工具的预想。

1992年Jamey Marth博士的研究团队发现了Cre-Lox可以对转基因动物体内特殊T细胞中由loxP序列所夹的染色体DNA进行高效地删除，他们由此提出这一技术可以用于确定特定细胞类型中内源基因的功能、标记细胞命运决定中的祖细胞、诱导染色体重组以构建疾病生物学模型、以及确定早期基因损伤对疾病发展的作用。1993年，有研究者报道获得了具有loxP侧位（floxed）DNA聚合酶基因的多能胚胎干细胞。

结合上述的发展，在1994年，德国科学家K Rajewsky博士实验室报道了Cre-Lox重组可以用于小鼠T细胞发育中的条件性基因敲除，此后的文献中重组的效率不断提高。此后Cre-Lox技术的发展使生物医学研究中条件性诱变得到广泛使用，使之成为确定特殊细胞类型和发育阶段中基因功能的主流方法。

Cre/loxP系统基因重组原理

当基因内存在loxP位点且有Cre重组酶存在时，Cre重组酶便会与loxP位点两端的反向重复序列区结合形成二聚体。此二聚体与其他loxP位点的二聚体结合，进而形成四聚体。随之，loxP位点之间的DNA序列被Cre重组酶切掉，切口通过DNA连接酶重新连接。DNA重组结果主要取决于loxP位点的方向及位置，主要存在以下几种重组方式：

1、两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相反，Cre重组酶诱导loxP间的序列翻转（Inversion）；

2、两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相同，Cre重组酶敲除（Deletion）loxP间的序列；

3、两个loxP位点位于不同的DNA链或染色体上，Cre重组酶诱导两条DNA链发生交换（Cassettechange）或染色体易位（Translocation）。

精准地诱导型Cre，调控基因敲除的“时空开关”

Cre工具鼠在Cre 重组酶表达系统上游采用不同组织或细胞特异性的启动子，就能够在特定的组织或细胞中表达Cre重组酶，而实现条件性基因敲除的空间特异性。

有了空间上的特异性，那么条件性基因敲除的时间特异性又是怎么实现的呢？

答案就是通过诱导型 Cre-loxP 系统来介导时间特异性的基因敲除，通过调控给予诱导剂的时间来人为操控基因敲除发生的时间。那么诱导型Cre有哪几种类型？

诱导型Cre分类包括启动子激活型和配体诱导型。启动子激活型通过诱导剂来调控Cre 重组酶的启动子活性。例如：四环素诱导型、干扰素诱导型。而配体诱导型主要通过将Cre 重组酶与激素受体配体结合（ligand-bindingdomain，LBD）相融合，形成定位于胞浆的融合蛋白，只有在激素诱导后，融合的Cre蛋白才会发生构象变化从锚定蛋白HSP90上解离下来，进入细胞核，识别loxP位点并发生切割。例如：雌激素诱导型。

下面我们主要来讲解下目前最常用的雌激素诱导型Cre。

雌激素诱导型Cre，即CreER系统，也叫他莫昔芬（Tam）诱导的Cre系统。将Cre与雌激素受体ER融合，可通过他莫昔芬（Tam）诱导Cre的重组活性。在没有他莫昔芬的情况下，CreER融合蛋白与热休克蛋白90（HSP90）相互作用并存在于细胞质中。在给予他莫昔芬的情况下，他莫昔芬（Tam）作为抗雌激素药物会与雌激素受体ER结合，从而破坏HSP90与CreER的相互作用，诱导Cre释放并进行核易位。在细胞核中，CreER识别loxP位点并使相应组织中的基因Y失活。

为了避免内源雌激素的干扰，在雌激素受体ER的配体结合区（LBD）做一个点突变（G521R）就可以使 Cre-ER 只响应外源的人工合成雌激素（比如：Tamoxifen、4-OHT）的诱导，命名为 Cre-ERT。而另一种LBD 突变体融合蛋白被证明对4-OHT 具有远高于Cre-ERT 的敏感性，这种突变体就是大名鼎鼎的Cre-ERT2。它带有人ER LBD 中的3 个点突变：C400V/M453A/L544A。CreERT2在体内对药物诱导的敏感性更高，因此一般优选使用CreERT2。

应用Cre/loxP进行条件性基因敲除的原则

如何应用Cre-loxP系统来获取特定的条件基因敲除小鼠呢？

首先将loxP序列重组到需要删除DNA区域两端，该区域一般被称为flox区，获得的小鼠称为flox小鼠。Flox小鼠基因功能正常，可与在特定细胞或组织或特定时期表达Cre重组酶的Cre工具鼠交配后获得各种时空特异性基因敲除小鼠。

Flox区的选择需要考虑如下原则：

1、插入loxP的位置不能影响基因的正常功能。所以，loxP一般插入在exon两端的intron中或基因外区域，并且需距exon和转录起始位点需有一定距离，以免影响mRNA的剪切或启动子活性；

2、尽量选择靠前的长度是非3的整数倍的exon。如果无法选择靠前的非3的倍的exon，也可选择关键功能区域敲除；

3、尽量避免选择ATG所在的exon，因为存在着蛋白翻译以靠后随机的ATG起始得到功能正常蛋白的风险。如果选择删除ATG尽量多连带后续的exon一起删除；

4、Flox区不应包含其他基因的功能区域，包括启动子，CDS，UTR等区域；

5、Flox不宜过大，一方面模型制作难度增大，另一方面删除区域包含其他基因和未知功能区域的概率大大增加。

集萃药康自2018年10月份宣布发起“斑点鼠计划”，计划旨在基于CRISPR/Cas9技术在2021年内完成所有蛋白编码基因的cKO/KO小鼠品系创制，实现小鼠基因敲除模型的产品化。截至目前为止，集萃药康基于CRISPR/Cas9技术建立14000余小鼠品系，涵盖了肿瘤、代谢、免疫、发育、DNA及蛋白修饰等热门研究方向，部分品系处于活体现鼠状态，我们已逐渐实现小鼠全基因敲除模型资源库的产品化。