氰氟草脂对斑马鱼的影响：发育毒性和免疫毒性

摘要：氰氟草脂是一种广泛用于农业的芳香族苯氧基丙酸除草剂。 然而，尚未报道其对水生生物的免疫毒性。 本文采用形态学，免疫学，细胞学，生化和分子生物学方法研究了氰氟草脂对斑马鱼发育毒性和免疫毒性的影响。结果表明，斑马鱼暴露于氰氟草脂后，其胚胎长度缩短，卵黄囊水肿，免疫细胞数量明显减少，炎症反应和免疫细胞凋亡明显增多。另外，我们发现免疫相关基因和促凋亡基因的表达上调，JAK-STAT信号通路介导了氰氟草脂的免疫毒性作用。研究结果表明，氰氟草脂对斑马鱼具有发育毒性和免疫毒性，这项研究为氰氟草脂对水生生物的影响提供了新的内容。

关键词：氰氟草脂  斑马鱼  JAK-STAT   信号通路  免疫毒性

简介：由于除草剂可以高效，快速地控制杂草的生长，因此广泛用于水稻作物的除草，以提高农作物的产量。斑马鱼由于具有体外发育，受精，高繁殖率和广泛使用转基因品系等优点，作为理想的脊椎动物模型，在毒理学研究领域中发挥了重要作用。斑马鱼也代表了一种模式生物，已被广泛用于评估免疫学，神经行为，心血管功能和肝毒性。由于斑马鱼基因组和免疫系统与人类相对保守，因此在本研究中使用斑马鱼评估了氰氟草脂的免疫毒性。免疫系统对细菌，病毒和寄生虫的感染作出反应，以保持动态平衡。 JAK-STAT是调节先天和适应性免疫系统的中央信号通路。斑马鱼的先天免疫细胞主要包括嗜中性粒细胞和巨噬细胞。当发生炎症时，中性粒细胞会迁移到伤口以对抗感染性微生物，而巨噬细胞则主要负责吞噬病原体和组织碎片。斑马鱼在48 hpf时可观察到嗜中性粒细胞和巨噬细胞。斑马鱼的适应性免疫细胞主要是胸腺细胞，其主要功能是发育成成熟的T细胞，在6 dpf斑马鱼中可以观察到。

斑马鱼品系：本研究使用斑马鱼Tg（Lyz：DsRed），Tg（Rag2：DsRed）转基因株系和AB品系。在受精后24小时，用0.003%PTU处理胚胎以抑制色素沉着。

氰氟草脂暴露：用胚胎培养液制备氰氟草脂储备溶液（1 g / L），并储存在4°C。对于胚胎实验，将6hpf的斑马鱼胚胎随机分布在90mm培养皿中，密度为每孔30个胚胎，每孔含20 ml培养液。根据初步实验结果，氰氟草脂的最终浓度为0 mg/L（对照）、0.1 mg/L、0.25 mg/L和0.5 mg/L。每组重复三次，在28.5°C的恒温培养箱中培养。每隔一天更换一次氰氟草脂培养液，及时取出死亡胚胎，收集96hpf和6dpf的胚胎进行后续分析。

形态学终点分析: 利用立体显微镜对96hpf斑马鱼的心率、体长、卵黄吸收等参数进行了测定. 死亡率通过计算死亡胚胎总数对胚胎总数的比值得出，而心率是人工计算1分钟内的心跳次数。斑马鱼的体长是从尾巴到头部的距离，而卵黄区域是卵黄的侧面区域。

免疫细胞定量：Tg（Lyz：DsRed）转基因斑马鱼用于检测中性粒细胞的数量。 暴露于96hpf后，在蔡司立体显微镜下观察中性粒细胞。此外，在4℃下收集并固定幼虫，然后用苏丹黑B染色以突出中性粒细胞。巨噬细胞用中性红（2.5 mg / ml）染色30min，然后用胚胎培养液洗涤，后用蔡司立体显微镜观察。使用Tg（rag2：DsRed）转基因斑马鱼评估胸腺T细胞的变化，通过激光扫描共聚焦显微镜捕获红色荧光图像。

LPS感染与断尾：暴露于72 hpf后，将Tg（Lyz：DsRed）转基因品系与LPS和氰氟草脂一起处理至96 hpf，然后通过中性红染色观察巨噬细胞的数量以检测炎症反应。暴露96h后，用0.16%三卡因麻醉，在体视显微镜下切取尾鳍。切下尾鳍后4-6小时，在蔡司Discovery V20显微镜下观察并拍摄了伤口中中性粒细胞的聚集情况。

氧化应激分析：根据我们之前的报道，测量了ROS荧光强度。根据制造商的方法测量MDA的含量以及CAT和SOD的活性。 在SpectraMax iD3多模式酶标仪（美国）上测量吸光度，并将其标准化为总蛋白水平，以评估氰氟草脂暴露对胚胎氧化应激水平的影响。用吖啶橙（AO）染色观察凋亡细胞。据报道，96hpf暴露后，收集幼虫，用AO染色30分钟，用培养液冲洗几次，后用蔡司体视显微镜观察。斑马鱼幼体凋亡细胞被AO染色成绿点。

氰氟草脂对斑马鱼胚胎的发育毒性：为了评估氰氟草脂对水生生物中的发育毒性，将6 hpf的斑马鱼胚胎暴露于不同浓度的氰氟草脂中96小时。为了检测氰氟草脂的急性毒性，将斑马鱼胚胎暴露于不同浓度的氰氟草脂中，计算不同时间点的累积存活率。结果表明，氰氟草脂以浓度依赖的方式引起胚胎高死亡率。根据测试浓度下的存活率，在96hpf时，氰氟草脂的半数致死浓度50（LC50）为1.0 mg / L。因此，在接下来的实验中，分别用0.1、0.25和0.5mg/L处理斑马鱼胚胎。发现，经氰氟草脂处理的胚胎体长明显短于对照组，但治疗组与对照组的心率无显著差异。此外，在三个治疗组的斑马鱼幼虫中均观察到卵黄囊水肿。数据表明，氰氟草脂对斑马鱼有发育毒性。

图1、氰氟草脂对斑马鱼胚胎的发育毒性。（A） 斑马鱼毒性实验示意图。（B） 不同浓度氰氟草脂对斑马鱼胚胎存活率的影响。（C） 斑马鱼胚胎在96 hpf（n=20）时暴露于不同浓度的氰氟草脂的体长。（D） 在96hpf条件下，不同浓度氰氟草脂下的斑马鱼幼鱼卵黄囊水肿，黑色区域代表卵黄囊。蓝色箭头指向心脏。E） 图1D所选区域卵黄囊水肿面积的统计图。数据用治疗组和对照组之间的变化表示。

氰氟草脂减少免疫细胞的数量：为了研究氰氟草脂对斑马鱼幼体的免疫毒性，我们检测了斑马鱼幼体固有的中性粒细胞、巨噬细胞和适应性胸腺T细胞的数量。首先，用Tg（lyz:DsRed）转基因斑马鱼检测中性粒细胞。与对照组相比，在96hpf时，治疗组尾侧造血组织（CHT）中性粒细胞数量明显减少，呈浓度依赖性。还使用苏丹黑B染色中性粒细胞以进一步验证这些结果，并获得相同的结果。此外，斑马鱼幼体后脑内巨噬细胞数量随着氰氟草脂暴露浓度的增加而逐渐减少。用Tg（rag2:DsRed）转基因斑马鱼追踪胸腺T细胞，发现在6dpf时，氰氟草脂处理组胸腺T细胞的大小和数量明显减少。

图2、氰氟草脂减少了先天和适应性免疫细胞的数量。（A）96 hpf Tg（lyz：DsRed）转基因斑马鱼幼虫尾中的中性粒细胞数量。将幼虫暴露于不同浓度（0.1 mg / L，0.25 mg / L，0.5 mg / L）的氰氟草脂，斑马鱼尾部的CHT区域用白色矩形表示。白色箭头标记阳性细胞。（B） 在96hpf时，用苏丹黑染料显示斑马鱼尾CHT区中性粒细胞数，白色箭头标记中性粒细胞。氰氟草脂的暴露浓度分别为0.1、0.25和0.5mg/L，白色矩形显示尾部的CHT面积。（C，D）图2A和B所选区域中性粒细胞数量的定量图。（E）96 hpf时暴露于下不同浓度的氰氟草脂下，斑马鱼胚胎头部的黑色巨噬细胞，，白色箭头标记阳性细胞。（F） 图2E中巨噬细胞数量的统计图。（G）暴露于不同浓度的氰氟草脂Tg（Lyz：DsRed）转基因斑马鱼幼虫中的胸腺细胞（红色荧光细胞）。胸腺的大小用白色虚线标出。（H） 图2G中胸腺面积大小的统计图。

氰氟草脂对炎症反应的影响：为了确定氰氟草脂暴露对免疫细胞功能的影响，我们对斑马鱼幼体进行了尾部切除和LPS感染实验。于96 hpf暴露后，去除尾鳍并检查了免疫细胞的迁移。结果表明，与对照组相比，斑马鱼幼体尾部伤口中性粒细胞数量明显减少，呈浓度依赖性。此外，与对照组相比，单独感染LPS的幼虫巨噬细胞数量明显增加。然而，巨噬细胞数量随着氰氟草脂浓度的增加而减少。表明，氰氟草脂对斑马鱼的炎症反应有影响。

图3、暴露于氰氟草脂会影响炎症反应。 （A）尾鳍切除后，Tg（lyz：DsRed）转基因斑马鱼幼虫暴露于不同浓度的氰氟草脂至96hpf，中性粒细胞迁移至伤口。黑色虚线表示尾鳍切除的位置，而白色和黑色的椭圆形表示中性粒细胞迁移到伤口的数量。白色箭头指向阳性细胞。（B） LPS诱导炎症反应。暴露于氰氟草脂和脂多糖后，斑马鱼头部后部的巨噬细胞数量。白色箭头指向阳性细胞。（C，D）分别为图3A和B中的白色虚线中的免疫细胞的数量

氰氟草脂诱导斑马鱼氧化应激：斑马鱼体内ROS、CAT、SOD、MDA等氧化还原参数的变化反映了机体脂质过氧化程度，反映了机体的抗氧化能力。与对照组相比，治疗组斑马鱼头部及心血管部位ROS荧光强度随氰氟草脂浓度的增加而增强。治疗组MDA含量、CAT、SOD活性均显著高于对照组。结果表明，氰氟草脂暴露可显著增加斑马鱼幼体的氧化应激。

图4、氰氟草脂诱导斑马鱼氧化应激和凋亡。

吖啶橙（AO）染色：本研究表明，氰氟草脂对斑马鱼有发育毒性、免疫毒性和氧化应激作用，氧化应激的原因可能与细胞凋亡有关。暴露于不同浓度氰氟草脂的斑马鱼幼虫在96 hpf时用AO染色，结果显示对照组的凋亡细胞数量明显低于治疗组。此外，我们还检测了凋亡相关基因的表达。在浓度为0.5 mg / L时，p53，Bax和caspase-3的mRNA水平明显高于对照组，而bcl-2基因的mRNA水平明显低于对照组。Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达水平与其mRNA水平一致。以上结果表明，氰氟草脂暴露可诱导斑马鱼幼体细胞凋亡。

图5、氰氟草脂上调斑马鱼幼虫中JAK-STAT信号通路相关基因的表达

JAK-STAT信号通路参与了氰氟草脂诱导的斑马鱼免疫毒性作用：为了研究免疫相关基因的表达，我们检测了暴露于0.5 mg / L氰氟草脂的斑马鱼幼虫中JAK-STAT信号通路相关基因的mRNA水平和蛋白质水平。JAK1、STAT3和下游炎性细胞因子TNF-α、CXCL-C1C、IL-6和IL-1β的mRNA水平显著上调，而负调控基因SOCS3b的mRNA水平显著下调。同时，与对照组相比，JAK1和STAT3蛋白水平显著上调。此外，JAK-STAT抑制剂ruxolitinib能抑制0.5mg/L氰氟草脂引起的斑马鱼幼体尾部中性粒细胞数量减少。该结果进一步表明，JAK-STAT信号传导途径影响了氰氟草脂对斑马鱼幼虫的免疫毒性。

结论：氰氟草脂对斑马鱼具有发育毒性和免疫毒性，为研究氰氟草脂对水生生物系统的影响提供了新的依据。未来的工作将集中在除草剂在其他生物学水平（包括生化和组织学水平）对斑马鱼的急性作用以及对代谢和后代的影响。

原文出自：Effects of cyhalofop-butyl on the developmental toxicity and immunotoxicity in zebrafish (Danio rerio) - ScienceDirect