神经生长因子在雌兔生殖生理中的作用

摘要：兔是反射性排卵动物，因此需要通过性交来释放GnRH并引发LH激增，从而触发成熟卵母细胞的排卵。但是该物种的排卵机制尚不清楚。神经生长因子β（β-NGF）是最近发现的在雌性生殖生理学中起作用的候选因子之一。这种神经营养因子及其高亲和力受体TrkA和低亲和力受体p75存在于卵巢，输卵管和子宫的所有隔室中，表明在卵巢卵泡形成，类固醇生成，排卵，黄体生成和胚胎发育中具有生理作用。此外，有证据表明，精浆中的β-NGF可在雌性下丘脑-垂体-卵巢轴上发挥调节作用，从而在自然交配过程中以内分泌方式参与GnRH神经元的肾上腺素能和胆碱能神经元刺激。神经营养因子在类固醇生成和排卵中的旁分泌和局部作用可能会强化导致排卵的神经内分泌途径。本文就β-NGF在家兔生殖过程中的作用，包括其对促排卵作用机制的可能贡献，并讨论了这种神经营养因子在兔场中未来应用的前景。

关键词：神经生长因子  兔 雌性 排卵  生殖道

神经生长因子系统：神经营养因子家族包含神经生长因子（NGF）以及脑源性神经营养因子（BDNF），神经营养因子3（NT3），神经营养因子4/5（NT4 / 5）和神经营养因子6（NT 6）。这些神经营养因子的生物学作用由两个细胞表面受体介导：一种称为酪氨酸激酶受体超家族的原肌球蛋白相关激酶（Trk）的特定高亲和力受体，以及一个来自促细胞死亡肿瘤坏死因子家族的称为细胞p75的非特异性低亲和力受体。神经生长因子β（β-NGF）是神经营养因子家族的创始成员，其特异性高亲和力受体为TrkA。β-NGF及其TrkA受体之间的相互作用涉及细胞内信号传导级联反应，例如ERK / MAPK和PI3K / AKT途径。神经生长因子最早是在组织中发现的，它是一种高分子量的∼140000 KDa的复合物，被称为7S-NGF。它可以分解为活性神经营养因子β-NGF（2.5S NGF）和两种丝氨酸蛋白酶（α-NGF和γ-NGF）。 神经生长因子β是负责该因子生物学活性的同型二聚体，由两个相同的亚基组成，每个亚基的分子量分别约为14,500 kDa。神经生长因子首先在神经系统中被发现，并被认为具有许多重要的调节功能，例如调节交感神经和感觉神经元的存活，发育和维持。但是，这种神经营养因子在非神经组织中表达并广泛分布于雌性和雄性中，包括生殖系统。事实上，在美洲驼、羊驼、骆驼、公牛、马、鹿、人和兔的精浆和绵羊、人和老鼠的卵泡液中都检测到。

β-NGF系统在雌性生殖中的作用：β-NGF系统在涉及内分泌，自分泌和旁分泌细胞信号传导的生殖过程中具有生理作用。一些数据指出其在卵巢，输卵管和子宫中的生理作用以及在排卵中的作用。

β-NGF系统对排卵期的局部影响：雌性生殖道受交感神经系统和外周感觉神经元的支配。在卵巢，交感神经支配突出，神经纤维可延伸至卵泡。在包括兔在内的几种物种的卵泡的卵泡膜，颗粒和卵丘细胞中产生神经生长因子β。卵巢局部产生这种神经营养因子表明它参与了关键事件，如控制卵泡形成步骤，卵泡组装，原始卵泡激活，卵泡生长和类固醇生成。β-NGF在排卵过程中的作用也很重要。因此，观察到，在一些物种中，排卵期卵泡膜细胞中TrkA mRNA增加，并伴随着与排卵前LH释放有关的β-NGF mRNA含量的增加。因此，当它与TrkA受体相互作用时，β-NGF可能是参与排卵反应的信号之一，因为它被认为是导致排卵周卵泡间隙连接破坏的罪魁祸首。卵泡壁的细胞解离引起卵泡破裂和成熟卵母细胞的释放。

神经生长因子β对卵母细胞成熟的影响在哺乳动物中尚未见报道。绵羊卵母细胞体外实验表明，卵母细胞成熟过程中单独添加β-NGF或与其他旁分泌因子联合使用可提高卵裂率和胚胎发育率。然而，不可能在其他物种中再现这种作用，到目前为止，尚未在兔中尝试过。在25 IU eCG的刺激下，对原始和初级卵泡的卵母细胞以及次级卵泡的颗粒和卵泡膜细胞中的β-NGF进行免疫定位。然而，在窦性卵泡中没有观察到免疫反应。排卵后（GnRH给药后7天），家兔黄体（CL）中β-NGF标记强烈，提示该结构局部产生神经营养素。此外，TrkA染色比排卵前稍强（图1a），这也突出了β-NGF在黄体生成过程中的重要性。β-NGF在通过TrkA形成CL的过程中具有强大的促黄体作用。神经营养素通过增加血管内皮生长因子和通过上调芳香化酶和甾体生成酶的表达来促进黄体酮的分泌，从而影响CL血管生成和血管形成。在雌兔中，这种促黄体作用不如骆驼类动物明显，并且尚未报道有关血管形成的信息。观察到p75在卵巢功能中的重要作用，因为它在排卵前后免疫定位于次级卵泡和腔前卵泡的内膜，而在窦性卵泡中几乎没有。尽管p75在其它组织中显示出细胞存活和凋亡的功能，但其在兔卵巢中的作用尚不清楚。

图1、代表性图像a）β-NGF，b）TrkA受体和c）p75受体在排卵前48h（发育中的卵泡）和GnRH给药后7天（黄体中期）用ecG刺激的家兔卵巢、输卵管和子宫中的免疫定位。比例尺：50μm。NC:阴性对照，Oo:卵母细胞，GC:颗粒细胞，Th:卵泡膜细胞，CL:黄体，Pf:初级卵泡，Sf:次级卵泡，Af:窦状卵泡，Ep:上皮细胞，ES:基质细胞，Gl:腺细胞。*表示免疫反应。

在自然交配或人工授精（AI）之后，精子的获能、受精和早期胚胎发育都在输卵管内进行。β-NGF对精子有不同的作用。此外，由于β-NGF及其受体在输卵管（包括漏斗、壶腹和峡部）中表达，该系统在胚胎发育的早期阶段起自分泌/旁分泌作用，包括兔。事实上，已有研究表明β-NGF直接影响兔早期胚胎的体外发育，在培养基中加入100和1000ng/mL的NGF可以提高孵化囊胚率。因此，β-NGF的另一种潜在的促黄体作用可能是由于对着床前胚胎的直接作用。未交配未刺激兔和家兔排卵前后子宫腔和间质上皮细胞中β-NGF和TrkA的表达水平均较高。Maranesi等人揭示β-NGF在子宫前列腺素（PGF2α和PGE2）合成中具有生理作用，这种作用是由一氧化氮合酶（NOS）和PGE2-9-酮还原酶（PGE2-9-K）介导的。前列腺素可影响黄体生成/黄体溶解，前列腺素e2是排卵和卵母细胞受精的关键介质。此外，低亲和力受体p75在一些子宫内膜和腺上皮细胞的基底区和顶端区分布不均，在排卵前这种分布更加不均，尽管p75在子宫中的作用仍有待研究。

β-NGF对兔促排卵作用的研究：重组兔β-NGF（rrβNGF）

兔的繁殖特征之一是雌性像骆驼、猫、田鼠和雪貂一样是反射性排卵。在所有这些物种中，排卵是由自然交配或人工授精引起的神经激素刺激触发的。β-NGF在诱导家兔排卵中的作用尚未明确。然而，最近的证据表明β-NGF可能参与这一过程，因为它在兔精浆中的丰富存在，浓度在2 ng/mL到150μg/mL之间。此外，以前在其他诱导排卵物种中也检测到精浆中存在β-NGF。尽管如此，根据同源和异源精浆对兔和骆驼的影响，一些研究者认为排卵过程可能是物种特异的。肌内注射兔精浆能够诱导骆驼排卵，并导致产生一种能产生氯离子的孕酮，正如用同种精浆处理的骆驼中观察到的那样。然而，在家兔体内注射同种精浆并不能诱导排卵，尽管观察到大量出血卵泡。Cervantes等人报告家兔静脉注射精浆可诱导群居家兔排卵，而单独饲养的家兔则不能。这些发现表明，社交和身体互动的感官刺激在该物种中可能很重要。此外，用异种骆驼精浆处理家兔，未发现排卵和CL生成。

在兔体内肌肉注射小鼠β-NGF后，观察到轻微的排卵反应。只有17%的治疗兔在没有刺激的情况下排卵，但记录到无排卵性出血卵泡的发生率很高。此外，治疗后2h未检测到LH激增。根据这些研究的结果，假设小鼠物种中存在不同的β-NGF亚型，表明氨基酸序列存在差异，可能会影响受体结合。尽管β-NGF蛋白在物种间高度保守，但β-NGF在TrkA信号复合物中的定位很重要。对诱导排卵和自发排卵雌性大鼠的氨基酸序列进行了详细的比较分析，揭示了兔和其他物种在神经营养素的某些受体结合位点上存在本质的差异。在家兔中，丝氨酸在TrkA结合位点被丙氨酸和脯氨酸取代，在p75结合位点有一种新的赖氨酸取代天冬酰胺和蛋氨酸。这些修饰可以影响外源性神经营养素（如小鼠）与家兔受体的结合。然而，在其他物种，如美洲驼，这似乎不那么相关，因为兔的精浆可以引起这种物种的排卵。

β-NGF在家兔生殖排卵中的作用机理：尽管骆驼科动物和兔中β-NGF的作用机理仍然未知，但这些物种之间似乎有所不同。据推测，β-NGF的作用主要是经静脉注射和静脉注射后的内分泌途径或子宫/阴道吸收。在美洲驼中，TrkA在下丘脑第三脑室室周区的存在可能表明β-NGF通过血脑屏障进入脑脊液。它会从这里传到中枢神经系统，其主要作用部位位于前下丘脑和下丘脑。然而，由于这些细胞对TrkA没有免疫反应，并且与p75没有共定位，因此似乎并不直接作用于分泌GnRH的神经元。神经元GnRH分泌的调节依赖于大量的输入， GnRH激活前的中间步骤。

然而，兔的研究强化了这样一种观念：神经通路对这种物种的排卵至关重要，而且β-NGF可以在下丘脑-垂体-卵巢轴中发挥调节作用。几项研究表明，精液中的一种成分，可能是β-NGF，可以触发兔的排卵。提出了β-NGF在兔雌性排卵诱导中可能的调节作用。

图2、β-NGF在兔排卵中调节作用的假说。 精液中引入的rrβ-NGF从阴道粘膜迅速吸收到血液中，并通过内分泌途径到达下丘脑的第三脑室。β-NGF通过一种未知的机制（神经肽Y或P物质或小胶质细胞刺激kisspeptin神经元），调节下丘脑基底内侧GnRH分泌和垂体释放LH。在本物种中，输精管所激发的神经刺激似乎至关重要，β-NGF可调节下丘脑和中脑的去甲肾上腺素能和胆碱能交感神经元对GnRH神经元的激活。此外，β-NGF可促进子宫（产生PGE2，参与黄体生成）和卵巢（促进类固醇生成，从而产生雌二醇，对GnRH释放和发情行为至关重要）。的旁分泌和局部作用。HP：下丘脑，P：垂体，Ac：前连合，Me：正中隆起，Oc：视交叉。黑点代表GnRH神经元，棕点代表去甲肾上腺素能神经元和胆碱能神经元。蓝色椭圆代表精浆中的β-NGF或通过阴道内途径给药。 粉红色的椭圆形表示雌性生殖道局部产生的β-NGF。

展望与未来应用：人工授精是商业化兔场的普遍做法，需要使用外源性激素如GnRH及其类似物来激发LH峰值，从而诱导排卵。这些化合物通常通过i.m.途径给予。然而，i.m.给药耗时、侵入性强。此外，它还可能对卵巢生理包括卵母细胞成熟产生有害影响。因此，研究工作的目标是通过在精液中加入GnRH类似物来避免i.m.途径。但是，这种做法也有缺点，例如需要高剂量来诱导排卵以及蛋白质的酶降解。

β-NGF在兔繁殖中的作用尚不清楚。最近的发现表明它可能在通过内分泌，旁分泌或自分泌途径诱导排卵中发挥调节作用。似乎神经刺激，主要通过交感神经元，是引起GnRH释放的因素。卵巢中局部β-NGF的产生可能促进类固醇生成，这可能是产生足够的雌二醇触发LH / GnRH激增的重要机制。现有数据进一步表明，肾上腺素能系统也可能参与甾体激素的生成，这决定了除了在雌性兔中起主要作用的物理刺激外，β-NGF和肾上腺素机制对于调节排卵可能是必需的。在未来的研究中，有待进一步阐明β-NGF干预生殖的机制。

原文出自：Role of nerve growth factor in the reproductive physiology of female rabbits: A review - ScienceDirect